一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术利用锁核酸能灵活修饰探针的特点，设计出用于检测地中海贫血基因点突变的探针，这些探针分别与不同编码的微珠进行耦联；然后设计本发明专利技术的特异性引物对突变位点进行扩增得到PCR产物，将其与耦联有探针的微珠进行杂交，再用荧光标记试剂进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪进行突变位点的检测。本发明专利技术基于LNA增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到2倍提高到超过4倍以上的差异，因而容易区分。

【技术实现步骤摘要】
一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法
：本专利技术属于分子诊断领域，具体涉及一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
：地中海贫血(Thalassemia)是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α地中海贫血(简称α地贫)和β地中海贫血(β地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国，是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万地贫基因突变携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚，广西地中海贫血以α地贫为主，基因携带率约为18％，广东省地贫的基因携带率约为16％，海南省约为7％，还有四川、湖南以及江西省，基因携带率约为人群的2％左右。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致产后大出血等严重的产科并发症，另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国乃至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。地贫的发病分子机制经过多年研究已非常清楚，α基因与β基因序列也非常明确。地贫基因突变的类型有明显种族与地域差异性，在全世界已发现200多种突变，而中国至今发现三十余种基因突变，但是98％左右集中在23种类型的突变，并在东南亚地区范围内，其分子机制大致相同。α地贫有三种比较常见的点突变，分别是122CAC→CAG,125CTG→CCG,142TAA→CAA点突变；β地贫的分子基础以点突变为主，其中常见的为17种:-32(C>A),-30(T>C),-29(A>G),-28(A>G),CAP+40-+43(-AAAC),InitiationcodonATG>AGG,CD14/15(+G),CD17(A>T),CD26(G>A),CD27/28(+C),IVS-1-1(G>T),IVS-1-5(G>C),CD31(-C)，CD41-42(-TCTT)，CD43(G>T)，CD71/72(+A),IVS-2-654(C>T)。目前已经有基于荧光定量PCR，反相斑点膜杂交方法，以及液相芯片方法和试剂盒来检测以上地贫基因点突变。反向斑点膜杂交方法，最终的检测结果是基于目测杂交点的杂交信号深浅度来判断，因此膜芯片上只设计了针对检测突变的探针；而液相芯片检测结果是把杂交的荧光信号转化数字信号，因此液相芯片检测点突变时，需要设计针对野生型的探针，和针对突变型的探针，最终计算野生型探针和突变型探针信号的比值来确定样本的基因型。在检测基因点突变时，最关键的因素是需要保证探针杂交的特异性，最理想的结果就是野生型探针只与野生型DNA片段杂交；突变型探针只与突变型DNA片段杂交，但实际工作中不会出现以上绝对的情形，总会有一些非特异性的背景信号产生。检测地贫基因型的准确度取决于特异性信号所产生的信号值是否较非特异性探针产生的信号值有较大的差异，以便容易区分。若野生型和突变型DNA有时只存在一个碱基的不同，按照常规方法设计的探针，往往会产生较高的非特异性杂交信号，导致不能明显地区分野生型还是突变型DNA片段。锁核酸(LNA-LockedNucleicAcid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。锁核酸修饰的探针在降低了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的熔解温度(Tm值)，并且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此锁核酸修饰的探针在增加检测基因点突变的特异性方面具有很大的灵活性。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针。本专利技术的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针上在合适的位置进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性，本专利技术的探针适用于微珠液相芯片杂交方法，该组探针包括地中海贫血基因突变中常见的发生单碱基突变的18种突变类型，对野生型、突变型检测的特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因突变类型。本专利技术的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针如表1所示：表1.基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针序列及其检测的突变位点注：其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示。核苷酸中核糖2'位置的氧原子和4’位置的碳原子之间形成亚甲基键锁住了3'位置磷酸骨架的移动，随着碱基不同，可以形成A/T/C/G锁核酸碱基。探针的5’端带有连接臂，可以和液相芯片所用的微珠生的-COOH基团发生化学耦合反应，使得探针连接到微珠上。所述的连接臂，优选为NH2-C12连接臂。本专利技术的第二个目的是提供一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物如表2所示：表2.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物序列在下游引物的5’端带有荧光标记修饰。所述的荧光标记修饰，优选为生物素荧光标记修饰。本专利技术的第三个目的是提供一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测试剂盒，包括多重PCR反应液、耐热DNA聚合酶、微珠、引物及探针，其特征在于，所述的引物序列上述表2所示，所述的探针序列如上述表1所示。本专利技术的第四个目的是提供一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、探针耦联：合成上述针对18个地中海贫血基因点突变位点的探针，将探针分别连接到不同编码的微珠上，探针与微珠耦联的步骤参考专利：ZL201110084698.6；(2)、样本PCR扩增：提取样本基因组DNA，利用上述针对18个地中海贫血基因点突变位点的引物，通过多重PCR的方法把要检测的突变位点一次性全部扩增出来，得到PCR产物；(3)、PCR产物和耦联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号：在杂交缓冲液中加入步骤(1)中得到耦联有探针的微珠，得到杂交缓冲液和微珠的混合液，然后将PCR产物与杂交缓冲液和微珠的混合液进行杂交，得到杂交产物，将杂交产物与荧光标记试剂混合进行反应，通过液相芯片检测仪分析每个样本的荧光强度中位数，当样本的荧光强度中位数高于平均背景的荧光强度中位数加10倍标准差，则是特异性杂交，完全匹配杂交的探针的杂交信号会强于不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下所示：其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，探针的5’端带有连接臂。

【技术特征摘要】
1.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下所示：其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，探针的5’端带有连接臂。2.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示：3.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的连接臂为NH2-C12连接臂。4.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物序列如下所示：P1-F：5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCAG-3’，P1-R：5’-CCTCAGGAGTCAGATGCACC-3’；P2-F：5’-AGAAGTCTGCCGTTACTGCC-3’，P2-R：5’-ATTGGTCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小庄，尹爱华，张亮，叶宁，刘畅，杜丽，
申请(专利权)人：广东省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广东;44