本发明专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及流感病毒H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒。本发明专利技术提供了检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的引物对和探针，用于检测流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型的引物对和探针，以及包括它们的试剂盒及试剂盒的使用方法。本发明专利技术提供的试剂盒具有良好的灵敏度、准确性和特异性，且使用简便快捷，能够在4小时内完成对待测样品的检测。经试验证实，该试剂盒检测阴性样品未见假阳性；对仅含H7N9亚型病毒的样品检测呈现100％的检出率；对同时含有H5N1亚型和H7N9亚型病毒的样品进行检测，也能100％的检出其中含有的H7N9病毒。且该试剂盒对含有2个拷贝以上的待测样品都能进行有效的检测。
【技术实现步骤摘要】
流感病毒H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及流感病毒H7N9亚型的液相芯片检测试剂盒。
技术介绍
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其流行特点是传播迅速，波 及范围广。迄今为止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，给人类社会的经济及健康造成 了巨大损失。 流感病毒属于正黏病毒科，其基因组为分节段负链RNA，根据病毒核衣壳蛋白 (NP)和基质蛋白（M)不同可分为甲、乙、丙三种型别，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群 中主要的流行病毒，甲型流感病毒根据病毒表面血凝素抗原的不同分为16个HA亚型；根据 神经氨酸酶抗原的不同分为9个NA亚型。 所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起 人类流感，现在已经确认能够感染人的禽流感病毒共有8种，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、 H7N7、H9N2、H10N7、H7N9。2013年2月底H7N9在中国长三角地区首次出现，2014年1月末 重新来袭，席卷中国12个省市，整个流行期发现了 347人感染，其中128人死亡，死亡率高 达35%，而且还有随时发生大规模流行的可能。因此，对流感病毒H7N9亚型做出早期、快速 的实验室诊断十分迫切。 流感病毒的实验室诊断方法包括病毒细胞培养、血清学诊断以及抗原检测。病毒 通过感染敏感的组织细胞可以被分离鉴定出来，这可以作为流感病毒感染最直接，最可靠 的依据。另外，急性期血清较恢复期血清抗体有4倍增加也是流感病毒感染的标准。但是 两者耗时较长，一般来说细胞培养需要3d?4d，血清学检查需要半个月。因此，这些方法 无法实现流感病毒的快速诊断。抗原的直接检测包括了对病毒结构蛋白以及核酸的检测。 病毒结构蛋白的检测基于抗原抗体的反应、偶联酶或者化学生色原或者荧光染料，包括免 疫突光（Immunofluorescence，IF)、酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)。直接或间接免疫荧光试验的敏感度波动在40%?100%，特异性在86%? 99%，但是由于需要荧光显微镜特殊仪器而限制了其在临床上的应用。在对病毒核酸的检 测和分型中，出现了很多快速特异的方法。特别是PCR技术的应用，对于流感病毒鉴定和 分型发挥着越来越大的作用。这些方法如：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、多重逆转录聚合酶链反应（multiplex reverse transcription-PCR，MRT_PCR)、酶免 PCR(PCR-enzyme immunoassay， PCR-EIA)、实时 PCR(real-time PCR，RT-PCR)等都大大的提高了检测的速度和灵敏度。 然而，尽管越来越多的方法用于检测流感病毒，但尚未有一种方法能够快速、简 便、准确的对流感病毒的H7N9亚型进行区分。因此建立一种对流感病毒各种型别进行快速 鉴定的方法就十分重要了。 液相芯片（Multi-Analyte Suspension Array, MASA)作为一种新型低密度基因芯 片技术通过悬浮阵列来实现多重检测。分子反应发生在经过颜色编码的微球体表面。针对 试验的每一目标检测物都有数千的核酸（互补链）或蛋白（如包被抗体）共价结合在颜色 编码的微球体表面。不同的颜色编码代表不同的检测物。在悬液中微球体与病人标本特异 性地结合，并加上荧光标记。然后，使用多功能流式点阵仪进行检测，乳胶颗粒首先被微量 液体传送系统排成单列通过两束激光，其中红色判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性 (定性）；绿色测定微粒上的荧光标记强度从而给被测物定量。最后，系统软件会搜集数据 并给出经分析处理后的结果。由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极 快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标，因此具有高通量、灵敏 度高、速度快、操作简便的特点。 目前液相芯片技术已经涉及到了生命科学的各个领域的研究中，包括临床诊断、 基础研究、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督和生物武器防范等。但是液相芯片技术的灵 敏度和准确性高度依赖于引物和探针的质量，必须保证引物和探针性质稳定、不产生发卡 结构或二聚体、产物长度不应超过500bp，且要保证不发生非特异性结合。尽管这些原则对 于一般引物设计而言并不复杂，但是由于流感病毒序列的过于复杂，目前尚无特异性和准 确度能够达到临床应用要求的液相芯片技术的引物和探针的报道。因此，设计高特异性、准 确度的引物和探针，将液相芯片技术应用于H7N9亚型流感病毒的检测具有十分重大的意 义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供流感病毒H7N9亚型的液相芯片 检测试剂盒，本专利技术提供的试剂盒操作简单，特异性、准确度皆较高。 本专利技术提供了检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的引物对，上游引物的核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 本专利技术提供了检测流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型的引物对，上游引物的核苷 酸序列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。 本专利技术提供了检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的探针组合，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO:5 所示。 本专利技术提供了检测流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型的探针组合，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO:6 所示。 本专利技术提供的引物和探针根据H7N9病毒设计，病毒序列主要来自NCBI和EBI的 核酸数据库，并参考WH0,美国CDC和中国CDC等的相关资料，经实验证实，本专利技术提供的引 物在58°C的退火温度下，经PCR扩增未产生非特异性条带或引物二聚体条带，证明本专利技术 提供的引物对具有良好的特异性。本专利技术提供的探针在43°C的杂交温度下未产生非特异性 杂交，证明本专利技术提供的探针具有良好的特异性。 本专利技术还提供了一种检测流感病毒H7N9亚型的试剂盒，包括：引物对A、引物对B 和探针A和探针B ;; 引物对A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示； 引物对B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示； 探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示； 探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。 在实施例中，本专利技术提供的试剂盒用于流感病毒H7N9亚型的液相芯片法检测。 在本专利技术的实施例中，本专利技术提供的试剂盒还包括：PCR扩增试剂、探针结合试剂 或微球杂交试剂。 在一些实施例中，PCR扩增试剂包括：PCR预混液、DNA Ploymerase和CldH2O ;探针 结合试剂包括：乳胶微球；微球杂交试剂包括：1. 5XTMC杂交缓冲液。在一些实施例中，本 专利技术提供的试剂盒还包括：藻红蛋白。 本专利技术提供的试剂盒具有良好的灵本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1. 检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO: 1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2. 检测流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序 列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。3. 检测流感病毒表面血凝素抗原H7亚型的探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。4. 检测流感病毒神经氨酸酶抗原N9亚型的探针组合，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:6 所示。5. 检测流感病毒H7N9亚型的试剂盒，其特征在于，包括：引物对A、引物对B、探针A和 探针B ; 所述引物对A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示； 所述引物对B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示； 所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示； 所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR扩增试剂、探针结合试剂或 微球杂交试剂。7. 根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：许黎黎，袁静，秦川，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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