一种猪H1N1亚型流感病毒血凝素重组蛋白的制备方法及该病毒抗体的液相芯片检测试剂盒技术

本发明专利技术首先提供了猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，通过去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有HIS标签的引物，构建了带有6*His‑麦芽糖结合蛋白（MBP）组合标签的原核表达质粒。在大肠杆菌表达系统中成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，利用该凝素重组蛋白建立液相芯片检测技术，灵敏度比ELISA高，该方法的建立，将为开展猪流感病毒抗体的检测提供必要的技术补充，为其它疫病抗体液相芯片检测技术的研究奠定技术基础，为多种猪病抗体多重液相芯片检测技术的建立提供试验依据。

Preparation method of recombinant hemagglutinin protein of swine H1N1 subtype influenza virus and liquid phase chip detection kit for the antibody of the virus

The present invention provides a method for preparing hemagglutinin recombinant protein of swine influenza virus by removing the signal peptide of HA. According to the design of a HIS tagged HA primer sequences, constructed with 6*His maltose binding protein (MBP) prokaryotic expression plasmid combination tag. A recombinant HA protein expressed in soluble form was successfully obtained in Escherichia coli expression system. The protein and H1N1 Subtype Swine influenza virus HA antibody reaction that HA recombinant protein has good antigenicity, recombinant protein based liquid chip detection technology using the coagulation, sensitivity is higher than ELISA, the establishment of this method will provide the necessary supplement for the detection technology to carry out the swine flu virus antibody and lay the foundation for other disease antibody Liquichip detection technology, to provide the experimental basis for a variety of swine antibody multiple Liquichip detection technology is established.

【技术实现步骤摘要】
一种猪H1N1亚型流感病毒血凝素重组蛋白的制备方法及该病毒抗体的液相芯片检测试剂盒
本专利技术涉及病毒检测
，更具体地，涉及一种猪H1N1亚型流感病毒血凝素重组蛋白的制备方法及该病毒抗体的液相芯片检测试剂盒。
技术介绍
猪流感(SwineInfluenza，SI)是猪流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床上以突发、咳嗽、高热、呼吸困难、精神沉郁、高发病率、低病死率为特征。目前，全球猪群中以经典猪流感H1N1和类人H3N2亚型为主广泛流行，尽管猪流感死亡率低，但是其可造成其他病原的继发感染，对养殖业造成巨大的经济损失。猪是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨种传播的中间宿主，是流感病毒基因重组的“混合器”，是引起流感大爆发的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒(pdm2009)在墨西哥、美国相继爆发，该流行毒株是由人流感、猪流感和禽流感病毒基因自然重组而形成的一种新型流感病毒。该毒株的PB1基因来于H3N2人流感，PA和PB2基因来自于北美禽流感，NA和M基因来自欧亚类禽猪流感，HA、NP和NS基因来自经典猪流感。该毒株能通过抗原的变异逃避机体的免疫系统，短时间内迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人们的关注。在猪场内进行定期的SIV抗体监测对于预防其它疾病的出现，以及在人群中流行具有重要的公共卫生学意义。液相芯片技术又称为Luminex技术、xMAP技术，是美国Luminex公司于20世纪90年代中期开发的一种多功能液相生物芯片检测技术。该技术集流式细胞技术、荧光技术、激光技术、传统的化学技术和计算机处理系统为一体新型多通道高通量生物芯片检测体系，具有高通量、重复性好、快速准确的特点。目前，液相芯片检测技术已被广泛应用于食品生产、医疗保健、环境卫生等领域的微生物检测，在呼吸道、虫媒介等病毒检测、细菌检测、基因检测、药物残留、细胞因子检测等方面广泛应用。2001年12月，美国食品与药物管理局(FDA)批准了用于临床诊断的液相芯片检测技术，该技术是唯一一个被FDA认证了的诊断技术。目前，猪流感病毒抗体诊断方法主要为血凝抑制试验(hemagglutinationinhibitiontest，HI)和微量中和试验(Microtitreneutralizationtest，MIVN)。其中，HI检测方法简单、易操作，但敏感性较差；MIVN检测方法敏感性和特异性好，但操作繁琐、周期长。鉴于此，需要建立一种操作简便、敏感性高、特异性强的方法，对目前进行补充和校对。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先提供一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供上述方法制备得到的猪流感病毒的血凝素重组蛋白。本专利技术的第三个目的是提供所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白作为免疫原在制备检测猪流感病毒的试剂中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种检测猪流感病毒的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1.去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。SIV的血凝素蛋白(HA)头部包含5个抗原决定簇，是流感病毒的主要表面抗原，可刺激机体产生中和抗体，从而起到保护机体的作用。同时血凝素是流感病毒亚型分类的依据，因此，HA蛋白是开发流感病毒疫苗以及检测方法的首选生物材料。本研究应用生物学软件SignalPV2.0.b2对HA基因进行信号肽分析，去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有His标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白(MBP)组合标签的原核表达质粒。MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码，大小约为40KD，在大肠杆菌表达系统中可增加目的蛋白的可溶性；同时，His标签便于重组蛋白的纯化，易于进行之后的实验。前期研究中发现，若去除HA基因的跨膜区，容易影响HA基因表达的抗原的完整性，影响其免疫原性。保留跨膜区也是为了保留HA基因的抗体完整性及其天然构象。使用pMAL-c5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose树脂纯化效率较低(即重组蛋白的纯化效率和纯化度低)，因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在HA基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni2+纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率。最终，本研究构建了带有6*His-MBP组合标签的原核表达质粒pMAL-cHA，成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，为H1亚型SIV抗体检测方法的建立奠定了基础。优选地，S2所述诱导表达的条件为IPTG0.3mM，温度37℃，时间2小时。因此，本专利技术还提供所述方法获得的猪流感病毒的血凝素重组蛋白。本专利技术还提供所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白作为免疫原在制备检测猪流感病毒的试剂中的应用。本专利技术以液相芯片技术为基础，以SIVH1N1HA重组蛋白为抗原，建立一种猪流感病毒抗体检测新方法。因此，本专利技术还提供一种检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA，是将所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白与羧基化荧光微球046(即第46号羧基化荧光微球)偶联获得。具体地，所述的检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA的制备方法，包括以下步骤：S1.羧基化荧光微球的活化：将清洗后的羧基化荧光微球046分别依次重悬于磷酸氢二钠缓冲液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中进行活化；S2.活化后的羧基化荧光微球046悬液中加入猪流感病毒的血凝素重组蛋白进行孵育，并用PBS-TBN重悬即得。本专利技术还提供一种检测猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒含有所述的猪流感病毒的血凝素重组蛋白，该猪流感病毒的血凝素重组蛋白可用于基于抗原抗体反应原理的免疫反应。优选地，所述试剂盒含有上述羧基化荧光微球46-HA，将偶联好的微球避光保存于4℃，3个月时间内仍然具有很好的稳定性。具体地，针对利用羧基化荧光微球46-HA进行液相芯片检测的技术，所述试剂盒还含有生物标记的鸡抗鼠IgG抗体或者兔抗猪IgG抗体、链霉素-枣红蛋白。更优选地，所述生物标记的鸡抗鼠IgG抗体的稀释度为1：1000，兔抗猪IgG抗体的稀释度为1：5000，链霉素-藻红蛋白的稀释度为1：1000。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首先提供了猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，通过去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有HIS标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白(MBP)组合标签的原核表达质粒。在大肠杆菌表达系统中成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，利用该凝素重组蛋白建立液相芯片检测技术，灵敏度比ELISA高，该方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA‑F和HA‑R引物扩增HA基因；其中，HA‑F和HA‑R引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；S2. 连接pMAL‑c5X载体，获得pMAL‑cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。

【技术特征摘要】
1.一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。2.根据权利要求1所述的猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，其特征在于，S2所述诱导表达的条件为：IPTG0.3mM，温度37℃，时间2小时。3.权利要求1或2所述方法获得的猪流感病毒的血凝素重组蛋白。4.权利要求3所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白作为免疫原在制备检测猪流感病毒的试剂中的应用。5.一种检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA，其特征在于，是将权利要求3所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白与羧基化荧光微球046偶联获得。6.权利要求5所述的检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂红，王衡，记方晓，孙彦阔，冀池海，曾梦，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44