本发明专利技术涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCRMGB-TaqMan探针检测方法，该方法利用荧光定量PCR技术，采用MGB探针，建立了猪圆环病毒2型（PCV2）检测方法。本发明专利技术具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单易被广泛应用的优势，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。达到猪圆环病毒2型快速、准确检测的目的。
【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型实时荧光定量^68-7301^3^探针检测方法
本专利技术涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量？(?探针检测方法，属于生物
，适用于？”2的快速准确检测。
技术介绍
猪圆环病毒2型现被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症的主要因素，同时还发现？”2与其它疾病相关，这些疾病包括肾病皮炎综合症、繁殖障碍、出生前心肌炎和弥散坏死性肺炎。近年来该病在我国和世界各地迅速传播，感染范围日趋广泛，给养猪业造成巨大的经济损失。 ？^2是猪圆环病毒…⑶两种基因型中的一种，为小颗粒、无包膜、环状单股0嫩病毒。目前？”2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光(^…、此^^免疫组织化学法(1110、原位核酸杂交等，但操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想，常规检测技术可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析，对低拷贝数的靶片段0嫩的有效扩增不理想，而且因交叉污染容易出现假阳性。实时荧光定量检测技术是近年来发展起来的一种新的0嫩/?嫩定量检测技术，已经越来越多的应用于人类和畜禽等动物传染病的诊断中。 实时荧光定量分为染料法和探针法，探针法较染料法又有着更高的灵敏度和特异性，检测结果更为可靠。矶荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭突光基团则在3’末端。扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收扩增时，丁叫酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条0嫩链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与产物形成完全同步。 本专利技术采用的1⑶探针与普通的探针相比，又具有实验结果更精确，分辨率更高的优势，168探针提高配对与非配对模板间的II值差异，并且探针3’端的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种猪圆环病毒2型实时荧光定量？(?探针检测方法，该方法利用荧光定量？⑶技术，采用服迅探针，建立了猪圆环病毒2型0(^2)检测方法。本专利技术具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单易被广泛应用的优势，168探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。达到猪圆环病毒2型快速、准确检测的目的。 本专利技术所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量？(? 1(^8-1^(112111探针检测方法，按下列步骤进行: 1设计与合成实时荧光定量？⑶检测的引物对，其序列为:上游引物？:5’ ^ 和下游引物尺:5’ -66^61^10^1^6166^10-3^ ； 以设计与合成实时荧光定量？⑶检测的探针，其序列为:5’ -^1)^00^X^000^60001X0X00 (168) -3，； 0,阳性对照标准品的制备:阳性对照标准品为实验室构建的含有？^20即2序列的克隆质粒9(^201^2序列来源于在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体1)1018-1，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为1，温度-201保存； 配制反应体系，按照反应程序进行反应得到目的片段，所述反应体系为:2父？0？ 188^61- 12.59 1，上下游引物各0.59 1，基因组0嫩29 1，去离子水补加至总体积 25 9 1 ；？邙反应程序为:9500 5111111,9500 308,58.6。。308，72。。2111111, 7200 10111111,35循环； 配制连接反应液，转化并提取质粒模板，所述连接反应液为快速连接混合液5 4 1，1)1018-1载体1 9 1，产物3 ^ 1，补加去离子水至总体积10 1 ； 测定质粒浓度,使最终浓度为1^10101)168/ ^ 1 ； 么定量？(?检测:将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量？(?检测，配制定量？⑶反应体系为:？1~6！11匕2乂 1叫12.5^ 1，上下游引物各0.5^ 1，探针0.25^ 1，基因组0嫩2 9 1，去离子水补加至总体积25111，反应程序为:温度951 308，温度951 58，温度57.400 308,40个循环，绘制标准曲线，然后以待测样品0嫩和标准品为模板做定量？⑶检测。 本专利技术所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量？(? 1(^8-1^(112111探针检测方法，该方法是通过以下技术方案实现的: 特异性引物和探针的设计和合成: 参照收录的？(^2基因组全序列选择保守区，采用美国八81 ？1~111161~2x1)1-688 3.0实时突光定量？(?引物设计软件，设计合成了 1对I叫探针及其引物，探针的荧光标记选择…1作为报告发光基团，1⑶为淬灭基团，探针和引物由公司合成。其序列为:引物？(上游):5 ’ -0001^161^01^010010-3 ’和引物I？(下游):5’ '魈I探针:5’ -(?^00^X^000^60001X0X00(168)-3^ ； 阳性对照标准品的制备: 阳性对照标准品为实验室构建的含有？^201^2序列的克隆质粒 ？^20即2序列来源于，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体？1018-1,制备一批质粒，测定浓度、纯度均合格的质粒进行定量，使最终浓度为1，温度-201保存，具体方法如下: 配制？⑶反应体系:2父？0？12.5 9 1，上下游引物各0.5 9 1，基因组0嫩2^ 1，去离子水补加至总体积25^ 1 ；？邙反应程序为:9500 5^111,95^ 308,58.6。。308，7212-11,721 10111111，35循环。回收并纯化？⑶产物，即为目的片段； 配制连接反应体系:快速连接混合液5 9 1，1)1018-1载体1 9 1，产物3 ^ 1，补加去离子水至总体积10^ 1，温度161孵育过夜； 转化并提取质粒模板:将连接产物转化至0册0感受态细胞中，涂板，选出阳性质粒克隆，测序，测定质粒浓度，使最终浓度为1，所提取的质粒即可作为后续试验的模板； 定量？邙检测: 将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量？(?检测，绘制标准曲线，然后以待测样品0嫩和标准品为模板做定量检测。 本专利技术所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量？(? 1(^8-1^(112111探针检测方法，该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好。本专利技术设计的特异性引物和探针，使实时荧光定量检测的定量极限和检测极限极低，大大提高了实时荧光定量检测方法的灵敏度，可实现大通量样品的检测，可对动物及动物源性样品中的猪圆环病毒2型进行实时荧光定量？⑶检测。 【附图说明】 图1为本专利技术的标准曲线图，其中横坐标为质粒模板拷贝数的对数，纵坐标为循环阈值； 图2为本专利技术标准曲线的熔解曲线图，其中熔解曲线的峰值出现在一个位置，结果成立； 图3为本专利技术不同稀释度标准样品的反应曲线图； 图4为本专利技术特异性检测的反应曲线图:其中检测样品分别为猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，猪细小病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，口蹄疫病毒，猪流感病毒所抽提的0嫩或⑶嫩为模板，结果显示除？^2之外其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB‑TaqMan探针检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：a、设计与合成实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：上游引物F：5’‑CCCTATGTAAACTACTCCTC‑3’和下游引物R：5’‑GGAAGTAATCAATAGTGGAATC‑3’；b、设计与合成实时荧光定量PCR检测的MGB‑TaqMan探针，其序列为：5’‑(FAM) ACCATAACCCAGCCCTTCTCC (MGB)‑3’；c、阳性对照标准品的制备：阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD18T‑PCV2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD18‑T，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/µl，温度‑20℃保存；配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段，所述PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5µl，上下游引物各0.5µl，基因组DNA2µl，去离子水补加至总体积25µl；PCR反应程序为：95℃ 5min，95℃ 30s，58.6℃30s，72℃2min，72℃ 10min，35循环；配制连接反应液，转化并提取质粒模板，所述连接反应液为快速连接混合液5µl，pMD18‑T载体1µl，PCR产物3µl，补加去离子水至总体积10µl；测定质粒浓度，使最终浓度为1×1010copies/µl；d、定量PCR检测：将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，配制定量PCR反应体系为：Premix EX Taq 12.5µl，上下游引物各0.5µl，探针0.25µl，基因组DNA2µl，去离子水补加至总体积25ul，反应程序为：温度95℃ 30s，温度95℃ 5s，温度57.4℃ 30s，40个循环，绘制标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测。...
【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，其特征在于，按下列步骤进行: a、设计与合成实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为:上游引物F:5’ -CCCTATGTAAACTACTCCTC-3’ 和下游引物 R:5’ -GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’ ； b、设计与合成实时荧光定量PCR检测的MGB-TaqMan探针，其序列为:5’-(FAM)ACCATAACCCAGCCCTTCTCC (MGB)-3’ ； C、阳性对照标准品的制备:阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV20RF2序列的克隆质粒pMD18T-PCV2，PCV20RF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体PMD18-T，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为IX KTcopies/^l，温度_20°C保存； 配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段，所述PCR反应体系为:2 XPCR...
【专利技术属性】
技术研发人员：师小潇，贺笋，潘晓梅，张伟，李延涛，
申请(专利权)人：新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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