血清miR‑630的荧光实时定量PCR检测试剂盒以及miR‑630的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种血清miR‑630的荧光实时定量PCR检测试剂盒以及miR‑630的应用，miR‑630能够在制备用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中得以应用；血清miR‑630的荧光实时定量检测试剂盒包括：miR‑630特异性引物和内参U6特异性引物等成分；本发明专利技术的血清miR‑630的荧光实时定量PCR检测试剂盒能够快速并准确地检测出目标血液中的miR‑630表达水平，从而获取移位骨化相关信息。

【技术实现步骤摘要】
血清miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒以及miR-630的应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种血清miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒以及miR-630的应用。
技术介绍
microRNAs(miRNA，miR)是一种小分子、非编码、单链的RNA分子，其能够通过特定的碱基配对方式结合到相应靶基因mRNA的非翻译区(3'UTR)，导致靶基因mRNA降解或抑制其稳定性，从而能够进一步调控相关靶基因的表达，参与相关细胞增殖、分化、凋亡等过程。异位骨化(HO)作为一种临床创伤和手术后常见的并发症，一直是困扰临床骨科医生的一大难题，其预防和治疗一直没有得到比较好的解决方法。当HO开始启动形成，其成熟趋势几乎是不可能逆转。一旦异位骨的形成造成了肢体功能的障碍且影响到了日常生活的质量，再次手术难以避免，其造成了二次伤害和费用不可低估。在以往的研究中，许多临床指标用来检验创伤性HO，如ALP，24h尿前列腺素水平，金属基质蛋白酶-9，用于早期去检测创伤性HO的发生。然而，这些现有的方法往往在敏感性和特异性上都比较局限，所以临床上预测创伤性HO能力是有限的。为了避免因为创伤性HO发生而再次手术，一些临床工作者试图将放射治疗应用于高危的患者中，主要集中在膝髋关节置换术后及脊柱损伤之后。但是对于放射治疗的副作用至今一直充满争议，DavisJA最新的临床研究发现通过Kocher-Langenbeck发的髋关节骨折内固定术后放射治疗，在预防创伤性HO的效果并无明显的统计学意义，且有导致肿瘤发生的并发症可能。McKeownSR通过其研究提出在良性疾病中，小剂量的放射治疗导致肿瘤的可能比较小，但也不可忽视，尤其对儿童和青少年的疾病的放射治疗的适用范围要尤其谨慎选择。考虑到放射治疗的适应症和副作用，因此这种方法限制了它在创伤后HO预防的临床应用。本专利技术人经过研究表明，血清中的miR-630的表达水平与异位骨的生成密切相关，其在创伤性异位骨化(heterotopicossification，HO)的发生过程中通过EndMT途径调控靶向Slug基因，因此，如何简单、快捷和准确地测定血清中的miR-630水平就成为一个亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种血清miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒，其能够快速并准确地检测出血清中miR-630的含量，以供操作人员判断其含量是否正常并且判断该血清的提供者是否发生异位骨化以及判断异位骨化所发生的阶段。本专利技术的另一个目的在于提供一种miR-630的应用。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：miR-630在用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中的应用。miR-630作为用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中的检测反应物的应用。一种血清miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒，其包括：miR-630正向引物、miR-630反向引物、内参U6正向引物、内参U6反向引物和qPCR反应液；miR-630正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；miR-630反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；内参U6正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；内参U6反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。其中，qPCR反应液的最终体积为20μL，包括：终浓度为1×的2xAllinOneTMqPCRMix、终浓度为0.2μM的qPCRPrimer、终浓度为0.2μM的UniversalAdaptorPCR、2μL的1ststrandcDNA、4μLddH2O。在qPCR反应液中，2xAllinOneTMqPCRMix的体积为10μL，qPCRPrimer的浓度为2μM且其体积为2μL，UniversalAdaptorPCR的浓度为2μM且其体积为2μL。荧光实时定量PCR体系的反应步骤为：(1)、按以下条件进行一次循环：先在95℃预变性10分钟再在95℃变性10秒；(2)、按以下条件依次进行四十次循环：先在57℃退火20秒，再在72℃延伸10秒。若miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒所检测出血清中miR-630的相对含量为0.93±0.03，则判定该血清的供体处于异位骨化创伤早期。若miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒所检测出血清中miR-630的相对含量为2.49±0.11至2.82±0.16，则判定该血清的供体处于异位骨化创伤后三个月之后的时期。上述技术方案所带来的有益效果是：本专利技术的血清miR-630含量的荧光实时定量检测试剂盒采用特异性的miR-630引物检测出该血清样品中的miR-630的表达量，同时采用内参U6校正其表达量，从而得到血清miR-630相对表达量，因此，本专利技术的血清miR-630检测试剂盒不仅成分简单，而且能够快速并准确地检测出目标血液中的miR-630表达水平，有利于操作人员快速判断目标血液是否正常，从而进一步判断目标群体是否发生异位骨的生成以及异位骨化的发生阶段。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实时定量PCR所检测的不同组中血清中miR-630的表达水平的图。图2为本专利技术的试剂盒所测定的正常人和HO患者血清中的miRNA630表达量的图；其中，纵坐标表示miRNA630的相对表达量，正常人的血清中的miRNA630表达量作为基准1；横坐标Normal组表示正常人，ImmatureHO组表示非成熟期的HO患者；MatureHO组表示成熟期的HO患者。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术公开了miR-630的应用以及用于检测血清中miR-630含量的荧光实时定量PCR检测试剂盒。<1>miR-630的应用本专利技术的专利技术人对创伤性HO患者血清中的miR-630的表达量进行了研究，同时通过年龄和性别匹配肘关节松懈术后未发生HO(heterotopicossification)的患者(Ctrl1)和骨折愈合的患者(Ctrl2)作为两个对照组，并对这两个对照组血清中的miR-630的表达量进行了研究。研究结果发现：在基准线，也即受伤(如进行肘关节松懈术)后8h，在HO患者的血清中，miR-630表达量为0.93±0.03，P<0.05；而在未发生HO的患者(Ctrl1)的血清中，miR-630表达量为2.58±0.12，P<0.05，并且在骨折愈合患者(Ctrl2)的血清中，miR-630表达量为2.51±0.09,P<0.05。由此可知，在受伤后8h，HO患者的血清中的miR-630表达量相对于未发生HO的患者(Ctrl1)和骨折愈合患者(Ctrl2)而言有了显著降低。当HO中异位骨可见的时候，也即受伤/手术本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR‑630在用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-630在用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中的应用。2.miR-630作为用于获取早期创伤性异位骨化信息的试剂盒中的检测反应物的应用。3.一种血清miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：miR-630正向引物、miR-630反向引物、内参U6正向引物、内参U6反向引物和qPCR反应液；miR-630正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；miR-630反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；内参U6正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；内参U6反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。4.根据权利要求3所述的miR-630的荧光实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述qPCR反应液的最终体积为20μL，包括：终浓度为1×的2xAllinOneTMqPCRMix、终浓度为0.2μM的qPCRPrimer、终浓度为0.2μM的UniversalAdaptorPCR、2μL的1ststrandcDNA、4μLddH2O。5.根据权利要求4所述的mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙仰白，李青峰，范存义，黎逢峰，蔡江瑜，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31