一种西江病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法，它涉及一种西江病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术的目的是要解决现有技术中没有西江病毒荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术方法为：一、设计引物；二、标准曲线构建；三、进行阴阳性判断。本发明专利技术的方法检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检测小于2个小时，操作简易，可以进行高通量的样品检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR检测方法，设及检测骗幅 源呼长孤西江病毒的SYBRGreenI巧光定量PCR通用检测方法，属于分子生物工程技术 领域。
技术介绍
西江病毒是2006年从骗幅肺脏中分离到的一株能够产生细胞合胞体的病毒，经 初步形态学鉴定、核酸电泳图鉴定、部分节段核巧酸序列鉴定该病毒属于正呼肠孤病毒纳 尔逊海湾病毒属的一个新的成员，根据纳尔逊海湾病毒的命名惯例，将其命名为西江病毒 (分离自我国广东省西江流域）狂RV)，运是我国目前为止第一次发现的骗幅呼肠孤病毒。 呼肠孤病毒科是一种重要的与呼吸系统和消化系统疾病密切相关的病毒。据国 际病毒分类委员会（ICTV)第八次报告，具有双链RNA(dsRNA)基因组结构的呼肠孤病毒 科巧eoviridae)包含了 12个属，所有能引起细胞融合的无囊膜病毒都存在于呼肠孤病毒 科。呼肠孤病毒科成员众多，就正呼肠孤病毒属而言，根据分离的宿主不同可分为5个种： 哺乳动物呼肠孤病毒（MRV)、禽呼肠孤病毒（ARV)、纳尔逊海湾病毒（NBV)、拂拂呼肠孤病毒 度RV)、爬虫类呼肠孤病毒（RRV)中，除MRV外其它种的正呼肠孤病毒都可W产生合胞体。 呼肠孤病毒具有广泛的宿主范围，骗幅也是自然宿主之一。从目前的研究发现看， 骗幅源的呼肠孤病毒处于一个独立的进化分支，与其它动物源的呼肠孤病毒不同。第一株 分离到的骗幅源呼肠孤病毒是1968年从澳大利亚纳尔逊海湾的飞狐屯、脏血中分离出的， 当时由于技术条件的限制，仅从其核酸带型上发现其具有独特之处，根据其来源地的名称 将其命名为化IsonBayOrthoreovirus(NBV),直到2006年，在对采自马来西亚的骗幅进行 亨德拉尼帕病毒进行回顾性调查时意外的从一只骗幅的尿液样品中分离出第二株骗幅源 的呼肠孤病毒，同样依据其样品来源地的名称将其命名为化Iauvirus任UlV) ,2007年王凌 发等报道了一株分离自马六甲的骗幅呼肠孤病毒将其命名为Melakavirus(MeLV),随后又 在香港、Kampar等地发现两株骗幅呼肠孤病毒，至此属于NBV种的呼肠孤病毒共发现5个 成员，运些成员有着W下的共同特点：（1)均为骗幅来源；（2)均W分离地点对其命名。（3) 与人类呼吸系统疾病有着某种关系，能够引起呼吸系统疾病的症状，但是其致病性高低不 明。西江病毒均符合上述特征，经过病毒全基因序列测定，表明西江病毒是NBV种呼长孤病 毒的一个新成员，与同种的其它成员在基因序列上具有区别，运是我国同时也是世界首次 发现的一个新的NBV种的呼长孤病毒。 运些处于独特进化分支的骗幅源呼肠孤病毒的发现引起了人们对其研究极大兴 趣，人们比较关屯、的问题是运些病毒究竟是否对人类或其它动物有致病性？运些病毒是与 呼吸系统的相关疾病有密切关系？同样由于此类病毒发现的数量不多，因此相关研究报道 比较稀少，同时也不够深入，仅限于流行病学调查和病毒的形态学鉴定，对于该病毒的生物 学特性、分子信息学、致病性研究几乎为空白。目前的调查研究发现：属于骗幅源的呼肠孤 病毒一一纳尔逊海湾病毒（NBV)能够引起人高烧和急性呼吸道症状，MelakaVirus(MeLV) 同样可W引起发烧、呼吸道疾病的症状，并且该病毒可W在人与人、人与骗幅之间传播。血 清学调查显示化IauVirus同样具有感染人的能力。近年来新发的可W引起高烧、呼吸系 统疾病的病毒性传染病的爆发流行，给人类健康及屯、理带来极大的危害和恐慌。因此关注 骗幅源的呼肠孤病毒对人类或其它动物是否具有致病性、其是否具有独特的生物学特性对 于应对呼吸系统新发传染性病毒病具有重要的公共卫生学意义。 由于对dsRNA病毒序列测定存在着一定的技术困难，再加上此类病毒发现的种类 比较少，相关基因信息极度匿乏，导致目前仅有此种病毒部分基因序列，尚无全基因组序 列，因此极大的限制了对其基因定位、结构、功能等方面的研究，而且没有快速的检测方法， 为是否为该病毒感染的诊断带来很大难题。 巧光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特点，SYBRGreenI巧光定量PCR利用 SYBRGreenI能结合到双链DNA的小沟部位放出巧光的方法广泛应用于核酸的特异性检 。在西江病毒的检测方法研究领域中目前尚无巧光定量PCR方法，因此建立一种快速、敏 感、特异的西江病毒巧光定量PCR方法更具有重要的实践意义。为该病毒感染的快速诊断、 开展流行病学调查具有重要的科学价值与公共卫生学意义。 经对现有技术的文献检索发现，国内没有西江病毒检测技术的专利公布。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是现有技术中没有西江病毒巧光定量PCR检测技术，而提 供一种西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR检测方法。 本专利技术的方法包括：西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR检测方法的建立、西江 病毒SYBRGreenI巧光定量PCR方法特异性检测、西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR 方法敏感性检测。 具体过程如下： 阳01引一、设计邸VSYBRGreenI巧光定量PCR引物 依据XRVSl基因序列，通过clustalxl. 81软件进行序列比对，确定XRV基因特异 序列区，在该区域设计特异性针对XRV的巧光定量引物；引物序列如下： 引物 1 :5'CTAACTCCGCTGACACGA3' ； 引物 2 :5'CAAACACTATTGACGCACAT3' ； 二、标准曲线的构建 依据步骤一设计的引物，WXRV全长Sl基因CDNA为模，进行巧光定量扩增，绘制 巧光定量标准曲线； 阳0化]S、实验成立标准 若空白对照无Ct值，且无规则扩增曲线，阳性对照Ct值应<35. 0,扩增曲线典型， 则实验成立； 四、判定阳性或阴性的标准 在实验成立的前提下，待测样品的Ct值^ 35.0,并且出现典型的扩增曲线，判断 为阳性；待测样品无Ct值并且无规则扩增曲线，判断为阴性。 阳02引本专利技术采用的XRVSYBRGreenI巧光定量PCR检测方法，具有W下优点： 本专利技术的方法检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检 测小于2个小时，操作简易，可W进行高通量的样品检测。 (1)特异性好。本专利技术可W特异性的检测XRV。似敏感性高。由于巧光定量PCR 利用扩增产物的积累和巧光信号建立对应关系，计算机辅助设备接受巧光信号并判定结 果。检测敏感性比常规PCR更高。（3)操作简单、高通量、防污染。使用巧光定量PCR检测， 不需要打开反应管盖进行琼脂糖电泳，不易污染后续待检测样品。操作简单，适合高通量大 规模样品检测。（4)节约时间。巧光定量PCR扩增产物较短，不需要PCR产物的延伸时间， 整个实验可W更快速完成。 本专利技术采用的XRVSYBRGreenI巧光定量PCR检测方法利用了PCR技术的核酸 高效扩增、SYBRGreenI巧光染料和计算机辅助巧光检测技术敏感性的优点，克服了常规 PCR检测的不足，极大的提高了检测的敏感性、特异性和操作的便利性。同时，本专利技术中采用 的阳性对照是根据西江病毒Sl基因序列体外转录的一段300nt的RNA分子，相对于W灭活 病毒液作为阳性对照的检测，增加了安全性，体外转录的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种西江病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、设计XRV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR引物依据XRV S1基因序列，通过clustalx1.81软件进行序列比对，确定XRV基因特异序列区，在该区域设计特异性针对XRV的荧光定量引物；引物序列如下：XRV‑F：5'CTAACTCCGCTGACACGA 3'；XRV‑R：5'CAAACACTATTGACGCACAT 3'；二、标准曲线的构建依据步骤一设计的引物，以XRV全长S1基因cDNA为模板，进行荧光定量扩增，绘制荧光定量标准曲线；三、实验成立标准若空白对照无Ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照Ct值应<35.0，扩增曲线典型，则实验成立；四、判定阳性或阴性的标准在实验成立的前提下，待测样品的Ct值≦35.0，并且出现典型的扩增曲线，判断为阳性；待测样品无Ct值并且无规则扩增曲线，判断为阴性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱妍，史子学，李素，潘铁骊，韩彩霞，盛尊来，张萍，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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