诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法技术

本发明专利技术涉及重组病毒载体和使用所述重组病毒载体诱导对甲型流感病毒的免疫反应的方法。本发明专利技术提供例如基于非复制改良型痘苗病毒安卡拉株的重组病毒载体。当根据本发明专利技术的方法施用时，所述重组病毒载体被设计为交叉保护的并诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法
本专利技术涉及重组病毒载体和使用该重组病毒载体诱导对甲型流感病毒的免疫反应的方法。本专利技术提供例如基于非复制改良型痘苗病毒安卡拉株的重组病毒载体。当根据本专利技术的方法施用时，该重组病毒载体被设计为交叉保护的并诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫。专利技术背景人类流感或称为“流行性感冒”是一种由甲型和乙型流感病毒导致的呼吸疾病。每年流感在全球范围内的流行导致大量疾病和死亡，而疫苗是预防感染和疾病的最直接对策。传统的流感疫苗使受体暴露于流感病毒蛋白，从而导致受体启动对该蛋白的免疫反应。疫苗中所用蛋白（或多肽）通常称为“抗原”。常用的季节性流感疫苗基于病毒的主要抗原：血凝素(HA)。存在大量具有不同HA抗原的甲型流感亚型。甲型流感亚型的区分和分类基于由病毒表达的HA和神经氨酸苷酶(NA)蛋白。甲型流感亚型的命名基于HA亚型（本领域已知的十六种不同的HA基因的亚型）和NA亚型（本领域已知的九种不同的NA基因的亚型）。示例性亚型包括但不限于H5N1、H1N1和H3N2。还存在称为“病毒株”的甲型流感亚型变种。例如，病毒A/VietNam/1203/2004是甲型流感病毒亚型H5N1，其病毒株名为A/VietNam/1203/2004。基于HA的季节性疫苗提供的预防具有病毒株特异性，并且新的病毒株不断产生，因此必须每年对传统的流感疫苗进行重新配制，以匹配当前流行的病毒株。参见Lambert和Fauci2010。因此，非常期望新一代疫苗为交叉保护的并诱导异源亚型免疫，即针对一种亚型的疫苗可预防或部分预防不同亚型的甲型流感的挑战感染。目前在开发中的“通用疫苗”（即，设计为引起异源亚型免疫的疫苗）主要基于更保守的内部流感病毒基因，它包括流感基质蛋白（M1和M2）（Schotsaert等人，2009）、核蛋白(NP)以及HA的保守部分（Bommakanti等人，2010；Steel等人，2010）。聚合酶蛋白PA、PB1和PB2还诱导实质性的T细胞应答，并且也可以是相关的标靶（Assarsson等人，2008；Greenbaum等人，2009；Lee等人，2008）。目前在开发中的新一代流感疫苗包括重组蛋白、合成肽、病毒样颗粒(VLP)、基于DNA的疫苗和病毒载体疫苗（Lambert和Fauci，同上）。使用活病毒载体的优点是它们已知可诱导高水平细胞免疫（特别是CD8T细胞）的特性。其中最有希望的病毒载体是基于痘苗病毒的活疫苗（Rimmelzwaan和Sutter2009）和基于腺病毒的载体（Hoelscher等人，2006；Hoelscher等人，2007；Price等人，2010；Zhou等人，2010）。使用表达NP和M2的腺病毒构建体进行的单剂量粘膜免疫例如提供了对强毒性H5N1、H3N2和H1N1病毒的预防（Price等人，同上）。在另一项研究（Price等人，2009）中，用核蛋白(NP)和基质2(M2)质粒进行DNA疫苗接种随后用抗原匹配的重组腺病毒(rAd)加强在小鼠和雪貂中提供了对强毒性H1N1和H5N1挑战的稳健预防。基于改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)的重组疫苗已用于许多非临床和临床研究中。已证实，MVA非常安全。在根治天花的情况下，对超过120,000名人类患者施用MVA，没有出现显著的副作用。由于病毒粒子形态发生中的阻断，高度减毒的痘苗病毒株无法在人类和大多数其他哺乳动物细胞中大量复制。然而，在早期和晚期表达病毒和外源基因的能力得以保留。这些特性使得MVA成为最有希望的诱导体液和细胞免疫反应并显示出较高的安全特性的活疫苗载体。美国专利No.6,998,252、7,015,024、7,045,136和7,045,313涉及重组痘病毒，例如牛痘。基于MVA的疫苗已例如针对HIV、肺结核、疟疾和癌症用于临床研究。在所有这些研究中，使用至少两个剂量。临床试验中施用的基于MVA的疫苗的人类剂量为5×107至5×108PFU（Brookes等人，2008；Cebere等人，2006；Tykodi和Thompson2008；）。MVA最近已用作大流行H5N1（Kreijtz等人，2008；Kreijtz等人，PLoSOne2009；Kreijtz等人，Vaccine2009；Kreijtz等人，J.Infect.Dis.2009；Kreijtz等人，2007；Mayrhofer等人，2009；Poon等人，2009）和H1N1（Hessel等人，2010；Kreijtz等人，J.Infect.Dis.2009）流感研究中的载体。表达NP和M1的基于MVA的疫苗目前正在进行中的临床试验中接受测试（Berthoud等人，2011）。因此，本领域仍然需要更广谱的保护性流感疫苗。具体实施方式本专利技术提供可用于对甲型流感病毒产生异源亚型免疫反应的重组病毒（本文也称为重组病毒载体）。该重组病毒为重组痘苗病毒，诸如重组MVA或本领域已知的其他非复制型或复制型痘苗病毒。非复制型痘苗病毒包括但不限于缺陷型痘苗李斯特株(dVV)、MVA-575(ECACCV00120707)、MVA-BN(ECACCV00083008)、MVA-F6和MVA-M4（Antoine等人，1998）。在一些实施例中，重组病毒编码融合蛋白(hlHA/M2e)，其包含具有至少一个甲型流感M2外部结构域(M2e)插入的甲型流感血凝素缺失突变体“无头HA”(hlHA)；hlHA/M2e融合蛋白和甲型流感核蛋白(NP)；或hlHA和NP。本专利技术的重组病毒还可以编码甲型流感基质蛋白1(M1)和/或甲型流感聚合酶PB1。当根据本专利技术的方法施用时，重组病毒为交叉保护的并且诱导异源亚型体液和细胞免疫反应（包括CD8和CD4T细胞应答）。因此，预期重组病毒可在人类中用作通用甲型流感疫苗。在一些实施例中，由本专利技术的重组病毒中的开放阅读框编码的hlHA氨基酸序列可以是例如SEQIDNO:15（基于为SEQIDNO:3的A/VietNam/1203/2004H5N1HANCBIGenbankAAW80717）所示的hlHA氨基酸序列。SEQIDNO:15的hlHA包含信号序列、SEQIDNO:3的HA1残基17-58、四个甘氨酸的连接肽、SEQIDNO:3的HA1残基290-343以及SEQIDNO:3的HA2茎区残基344-568。在一些实施例中，由本专利技术的重组病毒中的开放阅读框编码的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列可以是例如SEQIDNO:2中所示的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列。SEQIDNO:2的融合蛋白包含信号序列、SEQIDNO:3的HA1残基17-58、三个甘氨酸的连接肽(SEQIDNO:4)、H5N1的M2e（基于A/VietNam/1203/2004H5N1NCBIGenbankABP35634的SEQIDNO:5）、六个氨基酸的连接基GSAGSA(SEQIDNO:9)、H1N1的M2e（等同于H2N2和H3N2）（基于A/NewYork/3315/2009H1N1NCBIGenbankACZ05592的SEQIDNO:6）、六个氨基酸的连接基GSAGSA(SEQIDNO:9)、H9N2的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.31 US 61/438,0241.重组痘苗病毒，包含编码SEQIDNO:15的甲型流感无头血凝素hlHA多肽的第一基因盒和编码甲型流感核蛋白NP的第二基因盒。2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中所述NP由SEQIDNO:13中所示的氨基酸序列组成。3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子或selP启动子。4.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子或selP启动子。5.根据权利要求3所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子。6.根据权利要求4所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子。7.根据权利要求3所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于selP启动子。8.根据权利要求4所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于selP启动子。9.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子或selP启动子。10.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子或selP启动子。11.根据权利要求9所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。12.根据权利要求10所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。13.根据权利要求9所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于selP启动子。14.根据权利要求10所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第二基因盒的NP的表达受控于selP启动子。15.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达和来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。16.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒，其中来自所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达和来自所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。17.重组痘苗病毒，包含SEQIDNO:14中所示的hlHA第一基因盒和SEQIDNO:12中所示的NP第二基因盒。18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组痘苗病毒，还包含编码甲型流感M1的第三基因盒。19.根据权利要求18所述的重组痘苗病毒，其中所述M1蛋白由SEQIDNO:11中所示的氨基酸序列组成。20.根据权利要求19所述的重组痘苗病毒，其中所述M1蛋白由SEQIDNO:10中所示的核苷酸序列编码。21.根据权利要求1的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为改良型痘苗病毒安卡拉株MVA、缺陷型痘苗李斯特株dVV、MVA-575、MVA-BN、MVA-F6或MVA-M4。22.根据权利要求1的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为MVA。23.根据权利要求22所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入到所述MVA基因组的缺失I区、缺失II区、缺失III区、缺失IV区、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区或HA基因座中。24.根据权利要求22所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入到所述MVA基因组的缺失I区、缺失II区、缺失III区、缺失IV区、胸苷激酶基因座、D4/5基因间区或HA基因座中。25.根据权利要求22所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入到所述MVA基因组的D4/5基因间区中。26.根据权利要求22所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入到所述MVA基因组的缺失III区中...

【专利技术属性】
技术研发人员：法尔科京特·福科内尔，比尔吉特·沙弗尔，阿内特·何塞尔，P·诺尔·巴尔莱特，托马斯·R·克莱尔，哈特穆特·厄尔里西，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特医疗保健股份有限公司，
类型：
国别省市：