重组溶瘤流感病毒制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了重组溶瘤流感病毒制备方法和应用。本发明专利技术提供的重组溶瘤流感病毒，表达HTRP1与HTRP2；HTRP1为：A1)序列1所示蛋白质；A2)在序列1中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基、由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；HTRP2为：B1)序列3所示蛋白质；B2)在序列3中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基、由B1)衍生的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明专利技术提供的重组溶瘤流感病毒可靶向杀伤肝癌细胞，而对正常宿主细胞无明显影响，可用于肝癌靶向治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中，重组溶瘤流感病毒制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是严重危害人类健康的“杀手”，现有的临床治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向药物等手段，虽然有一定程度的临床疗效，但存在副反应大、效果有限、对人体正常细胞也造成很大杀伤力等问题。因此肿瘤治疗面临的巨大挑战是，如何高效、特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞组织无杀伤能力。随着分子生物学的发展及人们在基因水平对肿瘤的全新认识，新的肿瘤治疗方法应运而生。二十世纪九十年代，基因治疗开始运用到多种疾病的治疗中，并在一些遗传病中取得了一定疗效。这些进展极大促进了其在治疗肿瘤领域的发展，并为肿瘤治疗开拓了新思路。第一代肿瘤基因治疗载体，是利用病毒载体将抑癌基因导入人体的肿瘤细胞中，使抑癌基因发挥抑制、杀伤肿瘤细胞的作用。但肿瘤机制复杂，基因突变多样，一个或者两个抑癌基因的导入不足以抑制肿瘤细胞的生长，并且一些病毒载体不能在肿瘤细胞中转染，治疗效果并不明显。因此设计一种新的病毒载体，其可以特异性在肿瘤细胞中复制，选择性地在肿瘤细胞中生长，造成对肿瘤细胞的特异性杀伤。同时，由于病毒的复制，并从裂解的靶向细胞中释放出来，对周围细胞造成继续杀伤并裂解肿瘤细胞。这类病毒载体可以克服第一代肿瘤基因治疗载体的缺陷。这种病毒载体被称为溶瘤病毒。肿瘤细胞有自己的独立的不同于正常细胞的遗传特征，例如基因突变，基因表达异常等生理特征。然而肿瘤细胞在获得特殊的生长特权的同时，也更易成为病毒的宿主。例如：很多肿瘤细胞拥有对Ras激活凋亡的耐受，但反转录病毒因双链RNA激活的蛋白激酶R(PKR)被抑制而在此种细胞内生长旺盛。研究表明，Ras的活化和PKR的抑制有关。同时恶性肿瘤细胞表面的病毒受体表达量高，导致其更易成为病毒的宿主。一般来说，溶瘤病毒有效杀伤肿瘤细胞主要有以下几种机制：第一、病毒直接在肿瘤细胞中复制、包装及释放，病毒粒子的聚集以及肿瘤细胞转录翻译途径占用均导致癌细胞死亡。第二、病毒蛋白具有细胞毒作用或影响细胞功能，例如，细胞表达的抗原诱导机体产生细胞毒T淋巴细胞免疫反应。第三、病毒感染细胞后，增加了细胞对免疫反应的敏感性，即增加了细胞因子对细胞引起的免疫效果，从而造成对肿瘤细胞的杀伤。近年随着反向遗传学技术的迅猛发展，流感病毒作为载体表达外源基因成为可能。改造流感病毒作为载体表达外源基因有很多优势：(1)流感病毒具有易于改造的特性，利用肿瘤细胞与正常细胞不同的遗传特征，可靶向性作用于肿瘤目的细胞，为肿瘤的治疗提供新的研究策略；(2)能够诱导机体产生较强烈的体液、细胞和黏膜免疫应答，以及较全面的交叉免疫保护反应；(3)反向遗传学技术趋于成熟，对流感病毒进行定向改造和利用成为抗肿瘤研究的新途径。人H1N1流感病毒毒株A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。PR8为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤，尤其是对肝癌的治疗。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了重组流感病毒(名称为rFLU-HTRP，重组溶瘤流感病毒)，所述重组流感病毒为1)或2)：1)含有名称分别为HTRP1与HTRP2的蛋白质的病毒；2)表达所述HTRP1与所述HTRP2的病毒；所述HTRP1为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述HTRP2为下述B1)或B2)或B3)的蛋白质：B1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；B2)在序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。上述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、NA-RNA、HTRP1-RNA和HTRP2-RNA；所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA的RNA；所述HTRP1-RNA为编码所述HTRP1的RNA；所述HTRP2-RNA为编码所述HTRP2的RNA。上述重组流感病毒中，所述成套正链RNA也可仅由所述PB1-RNA、所述PB2-RNA、所述PA-RNA、所述NP-RNA、所述M-RNA、所述NA-RNA、所述HTRP1-RNA和所述HTRP2-RNA组成。上述重组流感病毒中，所述HTRP1-RNA的序列为将序列表中序列2的第41-289位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述HTRP2-RNA的序列为将序列表中序列4的第47-3817位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列。所述流感病毒毒株可为甲型流感病毒任一亚型(H1-H16、N1-N9)或乙型流感病毒任一谱系(B/Victoria、B/Yamagata)，具体可为A/PR/8/34。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述重组流感病毒的构建方法，所述方法包括将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HTRP1-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述HTRP2-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一产品：P1、所述的重组流感病毒的基因组；P2、用于治疗肿瘤的成套载体，由P2a与P2b组成：P2a、含有所述HTRP1的编码基因的载体；P2b、含有所述HTRP2的编码基因的载体；P3、用于治疗肿瘤的成套表达盒，由P3a与P3b组成：P3a、含有所述HTRP1的编码基因的表达盒；P3b、含有所述HTRP2的编码基因的表达盒；P4、用于治疗肿瘤的成套基因，由P4a与P4b组成：P4a、所述HTRP1的编码基因；P4b、所述HT本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组流感病毒，所述重组流感病毒为1)或2)：1)含有名称分别为HTRP1与HTRP2的蛋白质的病毒；2)表达所述HTRP1与所述HTRP2的病毒；所述HTRP1为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述HTRP2为下述B1)或B2)或B3)的蛋白质：B1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；B2)在序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
2016.12.30 CN 20161125335951.重组流感病毒，所述重组流感病毒为1)或2)：1)含有名称分别为HTRP1与HTRP2的蛋白质的病毒；2)表达所述HTRP1与所述HTRP2的病毒；所述HTRP1为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述HTRP2为下述B1)或B2)或B3)的蛋白质：B1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；B2)在序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其特征在于：所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、NA-RNA、HTRP1-RNA和HTRP2-RNA；所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA的RNA；所述HTRP1-RNA为编码权利要求1所述HTRP1的RNA；所述HTRP2-RNA为编码权利要求1所述HTRP2的RNA。3.根据权利要求2所述的重组流感病毒，其特征在于：所述HTRP1-RNA的序列为将序列表中序列2的第41-289位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述HTRP2-RNA的序列为将序列表中序列4的第47-3817位中所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述流感病毒毒株为甲型流感病毒或乙型流感病毒。4.权利要求1-3中任一所述重组流感病毒的构建方法，其特征在于：所述方法包括将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HTRP1-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述HTRP2-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。5.下述任一产品：P1、权利要求1-4中任一所述的重组流感病毒的基因组；P2、用于治疗肿瘤的成套载体，由P2a与P2b组成：P2a、含有权利要求1-4中任一所述HTRP1的编码基因的载体；P2b、含有权利要求1-4中任一所述HTRP2的编码基因的载体；P3、用于治疗肿瘤的成套表达盒，由P3a与P3b组成：P3a、含有权利要求1-4中任一所述HTRP1的编码基因的表达盒；P3b、含有权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏辉，王希良，张绍庚，任天宇，张培瑞，王兆海，孙芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇二医院，
类型：发明
国别省市：北京;11