一株重组狂犬病疫苗毒株制造技术

本发明专利技术公开了一株重组狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该毒株是以狂犬病毒LBNSE毒株为母本，将DCBP肽基因插入到所述LBNSE毒株的G基因信号肽序列之后，然后利用反向遗传技术拯救病毒，所述DCBP肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该毒株具有较高的安全性。可以诱导产生更高的中和抗体，提供更好的保护力，可作为新型狂犬病口服疫苗或者灭活疫苗的候选株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组狂犬病疫苗毒株，尤其是一种能有效激活树突状细胞(DCs)从而提高免疫原性的重组狂犬病疫苗毒株。
技术介绍
狂犬病毒(RABV)属于弹状病毒科，是单股负链RNA病毒。狂犬病是人类最古老的传染病之一，并且仍然对世界范围内的公共安全造成威胁。每年全世界有55,000人死于狂犬病，数百万人接受暴露后免疫。绝大多数的人类狂犬病例发生在亚洲和非洲的发展中国家，在这些国家，犬仍然是主要的传染源。RABV随唾液进入咬伤部位，在肌肉中短暂孵育后进入最近的神经纤维，并逐渐向脑移行，伤口部位离脑部越近，发病的潜伏期越短，病毒进入脑部的时间也越快，一旦进入神经系统，RABV复制和迁移将不易干涉。目前，疫苗免疫是预防和控制狂犬病的有效手段，依靠疫苗免疫宠物的方式在过去的50年中大大降低了狂犬病的发生。最近的研究发现树突状细胞(DCs)对保护性免疫的产生尤为重要。DCs是最有效的抗原递呈细胞，被激活后能够增强抗原诱导的体液和细胞免疫，在联系先天性免疫和获得免疫方面发挥重要作用。目前的疫苗大多是利用突变的狂犬病毒弱毒株生产的灭活疫苗或者缺失疫苗，生产过程对病毒滴度要求严格，成本高。如果能在传统疫苗基础上进行改良，使其激活DCs的能力增强，将有望增强传统疫苗的免疫原性，从而达到中和抗体滴度升高，保护率上升的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能有效激活树突状细胞(DCs)从而提高免疫原性的重组狂犬病疫苗毒株。申请人发现一种通过噬菌体展示技术筛选出的小肽DCBp(FYPSYHSTPQRP)能够与树突状细胞(DCs)结合并将其有效激活。本专利技术将DCBp肽插入狂犬病毒SAD突变株(G194，G333)——LBNSE毒株的糖蛋白基因的信号肽后，构建新型疫苗LBNSE-DCBp，研究发现该疫苗能显著提高疫苗激活DCs的能力，从而产生更多的中和抗体，更有效地为宿主提供保护力。DCBp肽由12个氨基酸组成，氨基酸序列为FYPSYHSTPQRP，核苷酸序列为ttctaccccagctaccacagcaccccccagaggccc(如SEQIDNO：1所示)。DCCp是一段不能与DCs结合的对照小肽，氨基酸序列为EPIHPETTFTNN。将小肽DCBp或DCCp按照图1所示策略PCR扩增出来后插入狂犬病毒疫苗株——LBNSE毒株，构建成新型疫苗LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp(构建策略如图2所示)。病毒拯救成功后，在BSR细胞上进行的多步生长曲线显示，小肽的插入并未影响病毒的复制(图3)。经体内试验表明，在LBNSE株G蛋白信号肽后加入DCBp或DCCp后，致病性不受影响。每组10只ICR小鼠分别脑内注射DMEM或1.6×106FFULBNSE或LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp每天记录小鼠体重变化，持续两周。结果显示在病毒G蛋白插入DCBp或DCCp小肽后小鼠体重变化不受影响，表明重组病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp与LBNSE的致病性无显著差异(图4)。体外试验显示，由小鼠骨髓细胞经GM-CSF诱导分化的DCs，按照病毒/细胞＝1的比率感染上述病毒，24小时后通过流式细胞仪检测树突状细胞激活的表面标志分子CD86和CD80，计算DCs激活比例，结果表明LBNSE-DCBp与LBNSE-DCCp和LBNSE相比激活DCs的能力显著提高(图5)。进一步的研究表明免疫了LBNSE-DCBp的小鼠产生更多的中和抗体。每组10只ICR小鼠肌肉免疫以上疫苗，在免疫后14,21,28,35和42天眼眶取血分离血清，FAVN法滴定狂犬病毒中和抗体。结果显示，中和抗体水平在免疫后21天达到最高，并持续至35天，且LBNSE-DCBp组的中和抗体显著高于LBNSE-DCCp和LBNSE组(图6)。我们将新型疫苗用于保护性试验，按1×106FFU的剂量肌肉免疫6-8周龄ICR小鼠，免疫后21天，经脑感染狂犬病毒强毒株CVS24，感染后每天记录小鼠死亡情况。结果显示LBNSE-DCBp组对小鼠的保护率高于LBNSE和LBNSE-DCCp组(图7)。表明LBNSE-DCBp是良好的潜在疫苗。出于安全性考虑，目前使用的狂犬疫苗主要是灭活疫苗，所以我们把疫苗用多聚甲醛灭活处理后肌肉免疫小鼠，发现LBNSE-DCBp产生中和抗体的能力(图8)和对小鼠的保护率显著高于LBNSE-DCCp和LBNSE(图9)。同时考虑到流浪犬和野生动物免疫的可能性，将疫苗经口服的方式免疫小鼠，观察小鼠产生中和抗体的能力(图10)和疫苗的保护率(图11)。结果显示无论是作为灭活疫苗还是口服疫苗，LBNSE-DCBp与LBNSE-DCCp和LBNSE相比，外周血中和抗体的产生都有显著升高，且保护率也明显上升。附图说明图1是PCR扩增DCBp和DCCp的方法示意图。图2是在狂犬病毒毒株LBNSE基因组中插入DCBp和DCCp的示意图。图3是重组病毒在BSR细胞上的生长曲线。图4是重组病毒经脑注射后对小鼠体重的影响。图5是重组病毒在体外激活树突状细胞(DCs)的能力检测。图6是重组病毒经肌肉免疫小鼠后，不同时间测得的小鼠血液中和抗体的滴度。图7是重组病毒经肌肉免疫小鼠后，不同时间测得的小鼠存活率。图8是重组病毒经灭活后肌肉免疫小鼠，不同时间测得的小鼠血液中和抗体的滴度。图9是重组病毒经灭活后肌肉免疫小鼠，不同时间测得的小鼠存活率。图10是重组病毒经口服免疫小鼠后，不同时间测得的小鼠血液中和抗体的滴度。图11是重组病毒经口服免疫小鼠后，不同时间测得的小鼠存活率。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1重组病毒的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价1材料和方法1.1材料1.1.1病毒LBNSE毒株，CVS24毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。1.1.2质粒用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的构建策略及具体方法可参考有关文献(WenY,WangH,WuH,YangF,TrippRA,etal.(2011)Rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.JVirol85:1634-1.)。1.1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株重组狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一株重组狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.一种制备权利要求1所述重组狂犬病疫苗毒株的方法，其特征在于：
以狂犬病毒LBNSE毒株为母...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌，张雅春，傅振芳，周明，崔旻，李莹莹，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42