冠状病毒制造技术

本发明专利技术提供了活的减毒冠状病毒，其包含编码多聚蛋白的变体复制酶基因，所述多聚蛋白包含在非结构蛋白(nsp)‑10、nsp‑14、nsp‑15或nsp‑16之一个或多个中的突变。所述冠状病毒可以用作疫苗用于治疗和/或预防受试者中的疾病(例如传染性支气管炎)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含变体复制酶基因的减毒冠状病毒，其导致所述病毒具有降低的致病性。本专利技术还涉及此类冠状病毒在疫苗中预防和/或治疗疾病的用途。专利技术背景禽传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性支气管炎(IB)的病原体，是家禽的高度传染性(infectious)和接触传染性(contagious)病原体，其主要在呼吸道中复制，但也在肠、肾和输卵管的上皮细胞中复制。IBV是网巢病毒目(Nidovirales)，冠状病毒(Coronaviridae)科，冠状病毒(Coronavirinae)亚科和Gammacoronavirus属的成员；遗传上非常相似的冠状病毒导致火鸡、珍珠鸡和野鸡中的疾病。IB的临床症状包括打喷嚏、气管痉挛、流鼻涕(nasaldischarge)和哮喘。肉型鸟具有减少的体重增加，而产卵鸟产较少的卵和产生质量差的卵。呼吸道感染使鸡倾向于继发细菌感染，其在雏鸡中可以是致命的。病毒还可以对输卵管造成永久性损伤，特别是在雏鸡中，导致减少的卵产生和质量；和对肾脏造成永久性损伤，有时导致肾脏疾病，其可以是致命的。已经报道了IBV比任何其他传染病对家禽业造成更多的经济损失。虽然活的减毒疫苗和灭活疫苗通常用于IBV的控制，但是由于疫苗分解(breakdown)或与所使用的疫苗无关的新IBV血清型的引入可以使得由使用疫苗所获得的保护丧失，这对家禽业造成风险。此外，为了改善接种程序的效率和成本效益，在工业上需要开发适合用于卵内使用的疫苗。与卵内接种相关的主要挑战在于病毒必须能够在母体衍生的针对病毒的抗体的存在下复制，而不对胚胎致病。当前IBV疫苗是在含胚卵中多次传代后衍生的，这导致对鸡具有降低的致病性的病毒，使得它们可以用作活减毒疫苗。然而，此类病毒几乎总是对胚胎显示出增加的毒力，并因此不能用于卵内接种，因为它们引起降低的孵化率。在一些情况下观察到孵化率70％的降低。在含胚卵中多次传代后的减毒还具有其他缺点。其是一种经验方法，因为病毒的减毒是随机的，并且在每次传代病毒时都不同，因此为了减毒的目的，相同病毒通过不同系列的卵的传代将导致引起减毒的不同突变的集合。还存在与该过程相关的功效问题：一些突变将影响病毒的复制，而一些突变可能使病毒过于减毒。突变也可以发生在S基因中，其也可以影响免疫原性，使得所需的免疫应答受到影响，并且潜在的疫苗可能不能针对所需的血清型进行保护。此外，存在与毒性的逆转和疫苗稳定性相关的问题。重要的是开发新的和更安全的疫苗用于控制IBV。因此，需要与这些问题不相关的IBV疫苗，特别是可用于卵内接种的疫苗。专利技术概述为了合理地减毒IBV，本专利技术人已经使用反向遗传学方法。该方法比在含胚卵中多次传代后的随机减毒更可控，因为每个突变的位置是已知的，并且可以推导其对病毒的作用，即减毒的原因。使用它们的反向遗传学方法，本专利技术人已经鉴定了导致病毒具有降低的致病性水平的各种突变。可以降低致病性水平，使得当将病毒施用于含胚卵时，其能够复制而对胚胎无致病性。此类病毒可适用于卵内接种，这是一个显著的优点，并且对在含胚卵中多次传代后产生的减毒IBV疫苗具有改进。因此，在第一方面，本专利技术提供了活的减毒冠状病毒，其包含编码多聚蛋白(polyprotein)的变体复制酶基因，所述多聚蛋白包含在非结构蛋白(nsp)-10、nsp-14、nsp-15或nsp-16之一个或多个中的突变。所述变体复制酶基因可以编码包含选自下列的一个或多个氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO:6第85位的Pro到Leu，在SEQIDNO:7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO:8第183位的Leu到Ile；在SEQIDNO:9第209位的Val到Ile。所述复制酶基因可以编码包含在SEQIDNO：6的第85位的氨基酸突变Pro到Leu的蛋白。所述复制酶基因可以编码包含以下氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO：7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO：8第183位的Leu到Ile；和在SEQIDNO：9第209位的Val到Ile。所述复制酶基因可以编码包含以下氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO：6第85位的Pro到Leu；在SEQIDNO：7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO：8第183位的Leu到Ile；和在SEQIDNO：9第209位的Val到Ile。与SEQIDNO：1所示的序列相比，所述复制酶基因可以包含选自下列的一个或多个核苷酸取代：在核苷酸第12137位的C到T；在核苷酸第18114位的G到C；在核苷酸第19047位的T到A；和在核苷酸第20139位的G到A。所述冠状病毒可以是感染性支气管炎病毒(IBV)。所述冠状病毒可以是IBVM41。所述冠状病毒可以包含至少一部分来自除M41之外的IBV血清型的S蛋白。例如，S1亚基或整个S蛋白可以来自除M41之外的IBV血清型。与表达相应野生型复制酶的冠状病毒相比，根据本专利技术第一方面的冠状病毒具有降低的致病性，使得当将病毒施用于含胚卵时，其能够复制而对胚胎无致病性。在第二方面，本专利技术提供了如与本专利技术第一方面相关所定义的变体复制酶基因。在第三方面，本专利技术提供了由根据本专利技术第二方面的变体冠状病毒复制酶基因编码的蛋白。在第四方面，本专利技术提供了包含根据本专利技术第二方面的复制酶基因的质粒。在第五方面，本专利技术提供用于制造根据本专利技术第一方面的冠状病毒的方法，其包含以下步骤：(i)将根据本专利技术第四方面的质粒转染至宿主细胞中；(ii)用重组病毒感染宿主细胞，该重组病毒包含具有复制酶基因的冠状病毒株基因组；(iii)允许质粒中的复制酶基因序列和重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组，以产生修饰的复制酶基因；和(iv)选择包含所述修饰的复制酶基因的重组病毒。所述重组病毒可以是痘苗病毒。所述方法还可以包括以下步骤：(v)回收重组冠状病毒，其包含来自步骤(iv)的重组病毒的DNA中的修饰的复制酶基因。在第六方面，本专利技术提供了能够产生根据本专利技术第一方面的冠状病毒的细胞。在第七方面，本专利技术提供了包含根据本专利技术第一方面的冠状病毒和药学上可接受的载体的疫苗。在第八方面，本专利技术提供了用于治疗和/或预防受试者中疾病的方法，其包含向所述受试者施用根据本专利技术第七方面的疫苗的步骤。本专利技术的另外方面提供：·根据本专利技术第七方面的疫苗，其用于治疗和/或受试者中的疾病。·根据本专利技术第一方面的冠状病毒在制备用于治疗和/或预防受试者中疾病的疫苗中的用途。所述疾病可以是传染性支气管炎(IB)。疫苗的施用方法可以选自由以下组成的组：滴眼施用，鼻内施用，饮用水施用(drinkingwateradministration)，孵化后注射和卵内注射(inovoinjection)。接种可以是通过卵内接种。本专利技术还提供了用于生产根据本专利技术第七方面的疫苗的方法，其包含用根据本专利技术第一方面的冠状病毒感染根据本专利技术第六方面的细胞的步骤。附图说明图1-M41-R-6和M41-R-12与M41-CK(M41EP4)相比在CK细胞上的生长动力学。图2-相比于M41-CK(M41EP4)和Beau-R，与M41-R-6和M41-R-12相关的临床症状，snicking和哮喘(wheezing)(柱从左至右显示每个时间点的模拟物、Beau-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
活的减毒冠状病毒，其包含编码多聚蛋白(polyprotein)的变体复制酶基因，所述多聚蛋白包含在非结构蛋白(nsp)‑10、nsp‑14、nsp‑15或nsp‑16之一个或多个中的突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.23 GB 1413020.71.活的减毒冠状病毒，其包含编码多聚蛋白(polyprotein)的变体复制酶基因，所述多聚蛋白包含在非结构蛋白(nsp)-10、nsp-14、nsp-15或nsp-16之一个或多个中的突变。2.根据权利要求1所述的冠状病毒，其中所述变体复制酶基因编码包含选自下列的一个或多个氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO:6第85位的Pro到Leu，在SEQIDNO:7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO:8第183位的Leu到Ile；在SEQIDNO:9第209位的Val到Ile。3.根据权利要求1或2所述的冠状病毒，其中所述复制酶基因编码包含在SEQIDNO：6的第85位的氨基酸突变Pro到Leu的蛋白。4.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其中所述复制酶基因编码包含以下氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO：7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO：8第183位的Leu到Ile；和在SEQIDNO：9第209位的Val到Ile。5.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其中所述复制酶基因编码包含以下氨基酸突变的蛋白：在SEQIDNO：6第85位的Pro到Leu；在SEQIDNO：7第393位的Val到Leu；在SEQIDNO：8第183位的Leu到Ile；和在SEQIDNO：9第209位的Val到Ile。6.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其中与SEQIDNO：1所示的序列相比，所述复制酶基因包含选自下列的一个或多个核苷酸取代：在核苷酸第12137位的C到T；在核苷酸第18114位的G到C；在核苷酸第19047位的T到A；和在核苷酸第20139位的G到A。7.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其是传染性支气管炎病毒(IBV)。8.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其是IBVM41。9.根据权利要求8所述的冠状病毒，其包含S蛋白，所述S蛋白的至少一部分来自除M41之外的IBV血清型。10.根据权利要求9所述的冠状病毒，其中S1亚基来自除M41之外的IBV血清型。11.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：E比克顿，S基普，P布里顿，
申请(专利权)人：皮尔布莱特研究所，
类型：发明
国别省市：英国;GB