带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法技术

带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法，涉及检测PCV2病毒的克隆体的构建方法，包括KT3标签引物的设计、感染性克隆（rPCV2‑KT3）的构建。本发明专利技术建立的感染性克隆（rPCV2‑KT3）可用作PCV2感染PCR诊断的标准阳性对照；用于疫苗免疫效果评价中抗体水平测定的靶抗原及临床诊断中PCV2病毒分离的阳性对照。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测PCV2病毒的克隆体的构建方法。
技术介绍
猪圆环病毒病（Porcinecircovirusdisease，简称PCVD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一类猪病的总称，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪的繁殖障碍。PCVD现已在全世界范围内发生和流行，其发病率可达60%，死亡率3%-10%，发病严重地区猪场在暴发本病时死淘率达到40%左右，给世界养猪业带来了巨大的损失。为控制猪圆环病毒病的流行，目前，商品化全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗已在世界各地养猪场应用，并取得较好的效果。但是这些疫苗接种成本较高，并不能完全阻断PCV2的传播。临床上最常用的检测PCV2病毒的方法是PCR方法，该方法往往需要阳性对照，通常的做法是使用PCV2强毒作为阳性对照，该做法存在两个问题，一是可能散毒，且一旦散毒后无法区分扩散的是检测用强毒还是流行的野毒；二是目标DNA难以定量；同样，测定猪圆环病毒病免疫效果，间接免疫荧光是常用方法，通常以PCV2强毒感染的PK-15细胞作为检测抗原，与PCV2病毒检测方法相似，该方法同样存在两个问题，一是存在散毒风险；二是作为目标抗原的PCV2病毒缺乏识别标记，当存在PCV2、PCV1污染时，难以区分测得的抗体是针对PCV1、还是PCV2的抗体。
技术实现思路
为了避免野生病毒制作的诊断抗原可能存在的污染、难以标准化等问题，本专利技术目的是提出构建带KT3标签的PCV2感染性克隆和带KT3标签的PCV2病毒。本专利技术包括以下步骤：1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的SacII限制性内切酶酶切位点；设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）标签（含11个aa：KPPTPPPEPET）的引入KT3的上下游引物引物；以PCV2唯一的酶切位点NcoI设计一对鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物；2）PCV2病毒DNA的提取；3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19-TVector，获得重组质粒pSK-KT3-dPCV2；5）将重组质粒pSK-KT3-dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3；6）构建pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒；7）构建pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒；8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。本专利技术目设计一对引物在PCV2全基因组的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）标签（含11个aa：KPPTPPPEPET），利用重叠延伸PCR方法，获得含KT3标签的全长序列，将其连接至pMD®19-TVector，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3。利用SacII限制性内切酶对重组质粒T-sPCV2-KT3进行酶切和胶回收，pBluescriptIISK(+)载体以同样限制性内切酶酶切、去磷酸化并回收，将两者的回收产物利用T4连接酶进行过夜连接、转化，获得pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒。利用PCV2基因组中唯一的限制性内切酶SacII、NcoI与NdeI进行酶切，获得三个目的片段，T4连接酶连接，获得首尾依次串联的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2。以电转染的方法转入Dulac细胞，经传代培养最终获得含KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。本专利技术借助分子克隆技术，在体外构建含猿猴病毒40大T抗原（KT3）的感染性克隆；感染性克隆电转化无PCV污染的PK-15细胞，获得带KT3标签的PCV2病毒。感染性克隆可用作PCV2感染PCR诊断的标准阳性对照；带KT3标签的PCV2病毒既可用于临床诊断中PCV2病毒分离的阳性对照，也可用于疫苗免疫效果评价中抗体水平测定的靶抗原。由于感染性克隆完全在体外构建，电转化过程也在完全可控的条件下进行，因此所获纯净的带KT3标签的PCV2病毒，避免了野生病毒制作的诊断抗原可能存在的污染、难以标准化等问题。本专利技术以上步骤1）中所述PCV2全长引物为：P1-SacII-F5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’；SacIIP2-SacII-R5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’。SacII所述引入KT3的上下游引物为：所述鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物为：PCV2-NcoI-F15’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’；NcoIPCV2-NcoI-R15’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’。NcoI以提取的DNA为模板，利用高保真酶与上游引物P1-SacII-F、下游引物P2-SacII-R扩增PCV2的全基因组（长度1767bp）。用引物P1-SacII-F/P4-KT3-Rp1扩增出一条580bp的片段，用P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R扩增出一条1200bp的片段。将两个PCR的产物，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段。利用重叠延伸的方法，再以全长引物P1-SacII-F/P2-SacII-R扩增出带有KT3标签的1800bp的全长基因组。步骤4）中通过连接pMD®19-TVector，利用感受态细胞大肠杆菌DH5α转化，获得重组质粒T-sPCV2-KT3。重组质粒T-sPCV2-KT3利用SacII限制性内切酶进行酶切和胶回收，pBluescriptIISK(+)载体同样用限制性内切酶SacII进行酶切、去磷酸化并回收，将两者的回收产物利用T4连接酶进行过夜连接、转化，获得pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒。利用PCV2上唯一的限制性内切酶SacII、NcoI与NdeI进行酶切，获得三个目的片段，T4连接酶连接，获得首尾依次串联的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2。步骤8）中所述将大量提取的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2电转化Dulac细胞，进行传代获得感染性克隆rPCV2-KT3，进行PCR鉴定和TCID50/mL的测定。本专利技术的有益效果：猪圆环病毒病是我国养猪业最重要的传染病之一，造成的经济损失难以估量。PCV2感染的实验室诊断，主要以PCR方法为主，因此，诊断用标准化核酸的需求量巨大；同时，PCV2疫苗免疫效果的评价，间接免疫荧光方法又是最常用的方法之一，纯净、标准化、带标签的PCV2自然具有巨大的市场需求，而带KT3标签的PCV2病毒正好满足了这一需求。本专利内容为PCV2感染的确诊、疫苗的评价提供了无可替代的新型工具，对我国猪圆环病毒病的防控将带来革命性的影响。附图说明图1为重组质粒pSK-KT3-dPCV2双拷贝感染性克隆的构建图。图2为KT3-PCV2全基因组的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中的电泳条带图。图3为重组质粒T-KT3-PCV2的PCR鉴定与酶切鉴定图。图4为单拷贝重组质粒pSK-KT3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的Sac II限制性内切酶酶切位点；设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端插入含猿猴病毒40大T抗原标签的引入KT3的上下游引物；以PCV2唯一的酶切位点Nco I设计一对鉴定pSK‑KT3‑dPCV2双拷贝重组质粒用引物；2）PCV2病毒DNA的提取；3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19‑T Vector，获得重组质粒pSK‑KT3‑dPCV2；5）将重组质粒pSK‑KT3‑dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T‑sPCV2‑KT3；6）构建pSK‑KT3‑sPCV2单拷贝重组质粒；7）构建pSK‑KT3‑dPCV2双拷贝重组质粒；8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2‑KT3重组病毒。

【技术特征摘要】
2016.09.07 CN 20161080633471.带KT3标签的重组病毒rPCV2-KT3的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的SacII限制性内切酶酶切位点；设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端插入含猿猴病毒40大T抗原标签的引入KT3的上下游引物；以PCV2唯一的酶切位点NcoI设计一对鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物；2）PCV2病毒DNA的提取；3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19-TVector，获得重组质粒pSK-KT3-dPCV2；5）将重组质粒pSK-KT3-dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3；6）构建pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒；7）构建pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒；8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤1）所述PCV2全长引物为：P1-SacII-F5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’；P2-SacII-R5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’；所述引入KT3的上下游引物为：P3-KT3-Fp1：P4-KT3-Rp1：所述鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，王艳华，曹启明，高清清，王小波，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32