一种重组杆状病毒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组杆状病毒及其应用。所述重组杆状病毒整合了腺相关病毒的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件。其应用于制备基因治疗用重组腺相关病毒载体，灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，可有效解决rAAV大规模制备的难题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种重组杆状病毒及其应用。
技术介绍
重组腺相关病毒(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是基因治疗领域最具应用前景的载体之一。rAAV在神经科学研究以及疾病的基因治疗等领域具有重要作用和巨大需求。有研究数据表明，一次大型灵长类动物试验或临床基因治疗试验就需要约1015VG(VG，virusgenomes)的rAAV，是一般体外细胞试验或小鼠试验用量的成百上千倍。利用传统的三质粒共同转染HEK293细胞的方法，生产1014VG的rAAV病毒颗粒，就需要转染多达5000多个175cm2培养瓶的细胞，这种传统方法显然无法满足大规模试验的需求。目前利用杆状病毒表达系统大规模制备rAAV的方法主要有以下两种：两杆状病毒系统(TwoBacsystem)和依赖包装细胞系的一杆状病毒系统(OneBacsystem)。两杆状病毒系统的主要流程是，将AAV的Rep基因和Cap基因整合在一个杆状病毒基因组中，将ITR核心表达元件整合到另外一个杆状病毒基因组中，然后将上述两种重组杆状病毒共同感染宿主细胞，产生出rAAV。依赖包装细胞系的一杆状病毒系统的主要流程是，先建立诱导表达Rep基因和Cap基因的包装细胞系，这种包装细胞系整合了Rep基因和Cap基因表达元件，Rep基因和Cap基因分别置于杆状病毒晚期基因表达强启动子PpH调控下，在PpH启动子的上游加入了hr2增强子序列和AAV的Rep蛋白结合序列。在感染整合了ITR核心表达元件的重组杆状病毒后，包装细胞系中的Rep基因和Cap基因被诱导表达，进而产生rAAV。然而，前者由于两种杆状病毒共同感染细胞效率较低，无法充分利用每个细胞的产能，而且感染是个随机的过程，容易产生不含核酸的空壳缺陷rAAV颗粒，制备工艺条件优化起来比较复杂，不同批次制备的rAAV质量不稳定。后者由于依赖诱导表达Rep基因和Cap基因的包装细胞系，构建复杂，优良包装细胞系的筛选难度大，制备不同血清型的rAAV，就需要建立表达相应血清型Cap基因的包装细胞系，灵活性和通用性较差，难以推广。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种重组杆状病毒及其应用，其目的在于通过将腺相关病毒(AAV)的Rep基因、Cap基因和ITR核心表达元件整合在杆状病毒基因组中作为重组腺相关病毒(rAAV)的表达载体，由此解决现有的大规模制备rAAV方法存在的灵活性差、通用性低、构建复杂或者病毒产量低、质量不稳定、生产成本高的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种重组型杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒基因组整合了AAV的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件。优选地，所述重组型杆状病毒，其Rep基因其序列为依据核糖体泄露扫描原理进行密码子优化的序列，优选为如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的序列。优选地，所述重组型杆状病毒，其Cap基因其序列为依据核糖体泄露扫描原理进行密码子优化的序列，优选为如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的序列。优选地，所述重组型杆状病毒，其ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与所述Rep基因和Cap基因的表达框相连，其包括位于两端的AAV基因组中的一段末端反向重复序列(ITR)以及位于中间的目标基因序列；所述ITR序列优选为如SEQIDNo.7所示的序列。优选地，所述重组型杆状病毒，其所述5’端或3’端连接核酸片段为长度在80bp-140bp之间的连接核酸序列，优选序列如SEQIDNo.8或SEQIDNo.9所示。优选地，所述重组型杆状病毒，其所述腺相关病毒为二型腺相关病毒。按照本专利技术的另一方面，提供了一种所述重组型杆状病毒的应用，其应用于制备基因治疗用重组腺相关病毒载体。优选地，所述应用，其包括以下步骤：(1)将目标基因作为功能基因构建在如权利要求1至6所述的重组型杆状病毒的基因组上，制备重组型杆状病毒；(2)将步骤(1)中制备得到的重组型杆状病毒，感染宿主细胞，产生大量重组腺相关病毒；(3)将步骤(2)中制备的重组腺相关病毒进行纯化。优选地，所述应用，其步骤(1)利用pFast.Bac.Dual穿梭载体，基于BactoBac系统。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：本专利技术公开的重组杆状病毒，通过基因设计和优化，利用一种杆状病毒提供了制备rAAV所需的复制包装元件，即AAV的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件，并保持了生物活性，打破了ITR与其他两个基因兼容的瓶颈。通过简单的细胞感染即能产出rAAV，其中的完整的rAAV颗粒比例较高，病毒质量高。而且，单个细胞的rAAV生产能力也大大提高。本专利技术Bac-A系统灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，可有效解决rAAV大规模制备的难题。附图说明图1是重组杆状病毒结构示意图，即整合了AAV的Rep基因、Cap基因和ITR核心表达元件的AcMNPVBacmid的示意图。其中杆状病毒AcMNPV基因组为双链环状DNA，的全长133,894bp，序列和图谱参考文献(Virology,1994.202(2):p.586-605.)，AcMNPVBacmid(bMON14272)的结构参考文献(JVirol,1993.67(8):p.4566-79.)，被整合的AAV的Rep基因、Cap基因和ITR核心表达元件插入到bacmid(bMON14272)的Tn7位点。图2是实施例1、2中重组杆状病毒系统及其制备rAAV的原理示意图。其中图2A是rAAV的包装原理图；图2B是杆状病毒表达系统穿梭质粒pFast.Bac.Dual(pFBD)的示意图；图2C是整合了制备rAAV所需组件的重组穿梭质粒结构示意图；图2D是重组杆状病毒感染Sf9细胞制备rAAV的过程示意图；图3是实施例1中3种组合方案制备的重组杆状病毒感染Sf9细胞的活性验证图。其中图3A是Sf9细胞对照组的荧光显微成像图，图3B是方案1至3制备的重组杆状病毒感染Sf9细胞3天后的实验组荧光显微成像图；图4是实施例1、2中3种组合方案制备的rAAV感染细胞的活性验证图。其中图4A是方案1制备的rAAV在HEK293细胞和Sf9细胞水平的活性验证结果，图4B是方案2制备的rAAV感染HEK293细胞的活性验证结果；图4C是方案3制备的rAAV感染HEK293细胞的活性验证结果；图5是实例4中纯化的rAAV颗粒透射电镜照片。其中图5A是rAAV颗粒负染后的透射电镜图，图5B是图5A的局部放大图(2.5倍)；图6是实施例5中纯化的rAAV在HEK293细胞水平和小鼠大脑水平的活性验证图。其中图6A是纯化后的rAAV感染HEK293细胞的荧光显微成像图，图6B是纯化后的rAAV感染小鼠大脑海马皮层神经元的荧光显微成像图，图6C是图6B的局部放大图(2倍)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组型杆状病毒，其特征在于，所述病毒基因组整合了腺相关病毒的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件。

【技术特征摘要】
1.一种重组型杆状病毒，其特征在于，所述病毒基因组整合了腺相关病毒的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件。2.如权利要求1所述的重组型杆状病毒，其特征在于，所述Rep基因其序列为依据核糖体泄露扫描原理进行密码子优化的序列，优选为如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的序列。3.如权利要求1所述的重组型杆状病毒，其特征在于，所述Cap基因其序列为依据核糖体泄露扫描原理进行密码子优化的序列，优选为如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的序列。4.如权利要求1所述的重组型杆状病毒，其特征在于，所述ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与所述Rep基因和Cap基因的表达框相连，其包括位于两端的腺相关病毒基因组中的一段末端反向重复序列(ITR)以及位于中间的目标基因序列；所述反向重复序列优选为如SEQIDNo.7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳，徐富强，何晓斌，
申请(专利权)人：中国科学院武汉物理与数学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42