一种表达施马伦贝格病毒重组N基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用技术

一种表达施马伦贝格病毒重组N基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用，参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB，等等。本发明专利技术的有益效果为，开展了SBV核蛋白在昆虫细胞上的表达，最终通过蛋白电泳、免疫印迹的方法表明实验获得了具有生物活性的SBVN蛋白，准确地鉴定了Vbacmid-SBV-N杆状病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种杆状病毒的制备、鉴定及其应用
，具体为一种 Vh〇"d-SBV-N杆状病毒的制备、鉴定及其应用

技术介绍
施马伦贝格病毒英文缩写：SBV，施马伦贝格病毒病是一种新发的、流行于欧洲的 动物传染病。SBV可引起牛、山羊、绵羊、野牛等动物发病，主要通过库朦传播，也可通过胎盘 垂直传播。主要的临床症状表现为发热、腹泻、乏力、死胎、崎形胎、产奶量下降、新生幼畜先 天缺陷等临床症状。SBV严重影响牲畜生产性能，危害畜牧业发展。欧洲是我国种畜引进及 畜产品进口的主要来源地区之一。鉴于SBV可能对我国畜牧业带来的巨大经济损失，研究 该病毒的检测方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术通过将SBVN基因重组于昆虫杆状病毒表达载体基因中，并将其在昆虫细 胞中成功表达。表达蛋白的获得为该病毒相应检测方法的研究奠定了物质基础。 本专利技术中Vh^id-SBV-N杆状病毒指的是表达施马伦贝格病毒N蛋白的杆状病毒。 本专利技术采用如下技术方案实现。 一种制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒方法，步骤如下： 1)参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对 含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因； 2)将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFas巧acHTB;如W步骤2得到的质粒转化DHlOBac感受态细胞，得到重组穿梭质粒 Bacmid-SBV-N； 4)将步骤3得到的重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N在脂质体介导下转染S巧昆虫细 胞，得到Vbacmid-SBV-N的杆状病毒。 一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的鉴定方法，步骤为，取Vbacmid-SBV-N杆状病毒， 按1:1~1:10的比例感染Sf9昆虫细胞，27°C培养96h~12化后，取培养的病毒上清液， 通过SDS-PAGE方法进行病毒鉴定：使用Bio-Radmini电泳仪，参照Bio-Radmini电泳仪 操作手册说明书，对培养的病毒上清液进行SDS-PAGE电泳，同时做两块凝胶，一块用于染 色分析，另一块用于Westernblot分析。SDS-PAGE电泳后，蛋白质分子量在29. 6邸处出现 一条特征性的条带。 通过SDS-PAGE方法进行病毒表达特征蛋白鉴定后，再通过Western blot方法对 病毒表达特征蛋白进行鉴定：用Bio-Rad转膜仪将SDS-PAGE凝胶电泳的各蛋白条带转移至 固相载体硝酸纤维素膜上，W抗SBV核蛋白的单克隆抗体1F2 (1:1000倍稀释）为一抗，羊 抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀释）为二抗做Western blot分析，蛋白质分子量在29. 6邸处出 现一条特征性的条带。[001引一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物，SBVF: 5' -TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3' ;SBVR:5' -ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'。 一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物的酶切位点，SBVF的酶切位点为 GGATCC;SBVR的酶切位点为CTGCAG。 一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒稳定表达SBV的 核蛋白：N蛋白。 一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒与抗SBVN蛋 白的单克隆抗体存在免疫学反应。 一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV 核蛋白，作为SBV抗体检测中酶联免疫吸附试剂制备中的包被用抗原。 一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV 核蛋白，作为SBV抗体检测中，胶体金试纸条制备中的金标物质。 本专利技术的有益效果为，专利技术人基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优 点一-表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，开展了SBV核蛋白在昆虫细胞上 的表达。在表达SBV蛋白的过程中，专利技术人为了控制转染过程中试剂、操作等因素造成的误 差，在转染时，W实验室前期构建的Bacmid-GFP作为阳性对照，转染后通过观察绿色巧光 蛋白的表达证明转染过程的可靠性，最终专利技术人通过蛋白电泳、免疫印迹的方法表明实验 获得了具有生物活性的SBVN蛋白，准确地鉴定了Vhemid-SBV-N杆状病毒。 下面就附图和【具体实施方式】对本专利技术做进一步解释。【附图说明】 图 1 重组质粒SBV-N的PCR扩增图（Fig. 1PCRamplificationofrecombinant plasmidSBV-脚 其中：M.DM标准DL2000 ; 1-4.SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段（M.DMMarker DL2000;l-4.PCRproductsofrecombinantplasmidSBV-NwithSBVF/SBVRprimers); 图 2 重组质粒pMDlST-SBV-N的PCR扩增图（Fig. 2PCRamplificationof recombinantplasmidpMDlST-SBV-N)其中：M.DM标准DL2000 ; 1-2.pMDlST-SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段（M.DM MarkerDL2000 ; 1-2.PCRproductsofrecombinantplasmidpMD18T-SBV-NwithSBVF/ SBVRprimers)；图 3 重组质粒pFas1:BacHTB-SBV-N的酶切鉴定图（Fig. 3Identificationofthe recombinantplasmidofpFastBacHTB-SBV-Nbyenzymedigestion)其中：M.DM标准MarkerIV;1.pFas巧a地TB-SBV-N经BamI和PstI双酶切 (M.DNAMarkerIV; 1.Restrictionenzymeidentificationofrecombinantplasmid pFas巧a地TB-SBV-NbyBamI&PstI);图 4 重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N的PCR扩增图（Fig. 4PCRamplificationof recombinantshuttleplasmidBacmid-SBV-N)M.DNA标准DL2000 ; 1-5.Bacmid-SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段[002引（Μ.DNAMarkerDL2000;1-5.PCRproductsofrecombinantplasmid Bacmid-SBV-NwithSBVF/SBVRprimers)； 图 5 重组质粒Bacmid-SBV-N的PCR鉴定图（Fig. 5Identificationofthe recombinantplasmidBacmid-SBV-NbyPCR)其中：M.DNA标准DL10000 ; 1-11.Bacmid-SBV-N用引物M13F和M13R的PCR产物； 12.Bacmid用引物M13F和M13R的PCR产物；（Μ.DNAMarkerDL1000 O; 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备Vbacmid‑SBV‑N杆状病毒方法，其特征在于，步骤如下：1)参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；2)将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB；3)以步骤2得到的质粒转化DH10Bac感受态细胞，得到重组穿梭质粒Bacmid‑SBV‑N；4)将步骤3得到的重组穿梭质粒Bacmid‑SBV‑N在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞，得到Vbacmid‑SBV‑N的杆状病毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝俊虎，陈林，杨旭光，叶玲玲，纪仁春，杨云庆，祝贺，周晓黎，艾军，
申请(专利权)人：艾军，郝俊虎，叶玲玲，
类型：发明
国别省市：云南;53