本发明专利技术公开了一种重组杆状病毒无缝克隆的方法，包括两个主要构成元件：可线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段，上述两个元件在昆虫细胞内直接重组产生重组杆状病毒。线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段在昆虫细胞内的DNA重组涉及到10-50bp长同源臂的同源重组和/或非同源的末端连接。本发明专利技术可适用于高通量构建重组病毒，以及一步克隆多个基因多重表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中基因工程和蛋白工程，具体地说就是一种杆状病毒的 重组构建方法，可用于表达重组蛋白、构建基因治疗载体、制备伪病毒样颗粒疫苗等。
技术介绍
杆状病毒载体表达系统度EV巧是一种利用昆虫杆状病毒作为载体，在虫体内或 者宿主昆虫细胞中表达外源蛋白的真核表达系统。因其极晚期基因（地和PlO)启动子可 W强效驱动外源基因表达而常用于构建重组病毒，高效表达目的蛋白。自从1983年，Smith 等人利用AcMNPV作为表达载体高水平地表达了人0 -干扰素后，在近S十年间，BEVS表达 了成千上万的外源蛋白，因而成为继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞的=大表达系统之后 又一个重要的表达系统。 最早的BEVS是通过与野生病毒同源重组来实现外源基因的表达的，重组效率极 低，不到0. 1%，而且需要多轮隧斑筛选纯化病毒，技术复杂，耗时费力。后来，Kitts等人 将IacZ基因插入到多角体基因座位置，并在orfl629和orf603基因处各引入一个BSU36I 酶切位点构建了一种可W通过线性化获得复制缺陷型病毒的方法度acPAK系统），病毒DNA 被BSU36I线性化之后，由于缺失了复制所必需的基因orfl629,即使自连也无法产生有感 染力的病毒。线性化的该载体系统与转移载体共转染，同源重组获得重组病毒。但由于无 法保证病毒载体100%线性化，因此，仍然需要进行隧斑筛选W纯化病毒。随后Lee等在杆 状病毒DNA上引入细菌人工染色体片段度AC),建立了Bac-to-Bac的邸VS。该系统引入的 BAC片段具有细菌mini-F复制子、Tn7转座位点、卡那霉素化an)抗性基因，使病毒DNA能 够W质粒的形式在细菌细胞内复制，通过转座重组克隆目的基因，蓝白筛选获得单克隆重 组DNA，转染宿主细胞后复制扩增产生重组病毒并表达外源蛋白。Zhao和化ssee等分别建立了 一套复制缺陷型的病毒载体BAClO:K01629和 flashBAC。他们在基因组中插入一个低拷贝的mini-F复制子失活orfl629。运种方法结 合了BacPAK系统和Bac-to-Bac系统的优点，只需要构建一个重组转移载体，并与BAClO: K01629或fIashBAC载体共转染细胞就可W-步法获得重组病毒，无需筛选。 此外，也出现如酵母-昆虫细胞穿梭质粒载体系统和化e-loxP系统等杆状病毒重 组方法。国内，也出现一些新的重组病毒构建方法。但总的来说，运些方法，要么仍然需要 隧斑筛选，要么需要特定菌株重组克隆，要么借助特别重组酶和标记基因，杆状病毒重组方 法并没有新的突破。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供的一种，包括 两个主要构成元件：可线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组捶救DNA片段，上述两个 元件在昆虫细胞内直接重组（自行直接重组）产生重组杆状病毒。 作为本专利技术的的改进：所述线性化的复制缺陷型杆 状病毒载体和重组捶救DNA片段在昆虫细胞内的DNA重组设及到IO-SObp长同源臂的同源 重组和/或非同源的末端连接。 作为本专利技术的的进一步改进： 所述可线性化的复制缺陷型杆状病毒载体为在病毒基因组中W细菌人工染色体 片段（即包含miniF复制子的BAC片段）替代杆状病毒多角体基因座及复制必需基因 O计1629的3'端序列，并在BAC片段与orfl629之间引入一个单酶切位点BSU36I; 所述重组捶救DNA片段为一端包含orfl629缺失的3'端序列及其同源臂序列，另 一端包含或不包含BAC片段的同源臂。 作为本专利技术的的进一步改进：可线性化的复制缺陷 型杆状病毒载体，在与重组捶救DNA片段共转染时利用BSU36I酶切成线性的包含0rfl629 末端和BAC末端的单个片段。 作为本专利技术的的进一步改进：重组捶救DNA片段， 其一端包含的〇rfl629同源臂序列至少IObp长。 备注说明： 通常，同源重组中同源臂越长重组的概率越高。本专利技术已证实包含10到50bp同 源臂的重组捶救DNA片段均能与线性化病毒载体重组产生重组病毒，无同源臂的片段无法 产生重组病毒。 作为本专利技术的的进一步改进：所述重组捶救DNA片 段，可W是化学合成的，也可W是通过其他方法合成的包含除必需基因捶救DNA序列及同 源臂W外的其他序列DNA。 作为本专利技术的的进一步改进： 无缝克隆方法为：是通过重组捶救DNA片段与线性化的复制缺陷型杆状病毒载体 混合，然后一起导入昆虫细胞内，通过同源重组和/或非同源的末端连接产生重组病毒。 本专利技术的的技术方案具体如下： -种可线性化的复制缺陷型杆状病毒载体，运种杆状病毒载体在病毒基因组多角 体基因座插入细菌人工染色体片段度AC,包含miniF复制子、Tn7转座子位点和卡那霉素抗 性基因），并缺失复制必需基因OTf1629的3'端序列，化及在BAC片段与OTf1629之间引入 一个单酶切位点BSU36I。 上述可线性化复制缺陷型杆状病毒载体克隆过程包含如下步骤： 1)在杆状病毒穿梭载体度mBacmid，见专利ZL201210037290. 8,或者Bacmid bM0N14271)基础上，W氯霉素（Cm)抗性基因表达盒（CAT)作为打祀片段，通过Red重组，在 大肠杆菌细胞内敲除杆状病毒复制必需基因〇rfl629的3'端序列，同时在CAT两侧各引入 一个BSU36I位点，产生复制缺陷型的杆状病毒穿梭载体BmBacmid-CAT-K01629。 2)然后Bsu36I酶切去除CAT,通过T4DNA连接酶连接Bsu36I粘性末端，使酶切后 的分子自连，连接产物电转化DHlOB大肠杆菌感受态细胞，通过卡那霉素化an)抗性和氯 霉素（Cm)敏感性筛选获得消除CAT的重组Bacmid,即可线性化复制缺陷型杆状病毒载体 BmBacmid-K01629〇 本专利技术所述重组捶救DNA片段为一端包含orfl629缺失的3>端序列及其同源臂 序列，另一端包含或不包含BAC片段的同源臂，该重组捶救DM片段由由必需基因捶救DM片段、目的基因片段和启动子片段通过重叠PCR的方法合成，具体包含W下步骤：1)必需基因捶救DNA片段，为包含必需基因OTf1629缺失序列和同源臂的片段。[002引。目的基因片段，W目的基因DNA为模板，设计引物，PCR扩增合成，合成的目的基 因片段两端分别与必需基因捶救DNA片段和启动子片段有20-5化P的重叠。 3)启动子片段，根据目的基因定位的宿主W化学方法或PCR法合成相应的启动子 序列。 4)上述S个DNA片段，按照重叠PCR的方法合成包含目的基因表达盒和必需基因 O计1629缺失序列的重组捶救DNA片段。 本专利技术公开的重组杆状病毒无缝克隆方法，其DNA重组过程是，可线性化复制缺 陷型杆状病毒载体BmBacmid-K01629经BSU36I酶切而线性化，然后与重叠PCR合成的重组 捶救DNA片段混合，再共转染昆虫细胞BmN。在BmN细胞内，重组捶救DNA片段通过一端的 O计1629同源臂与线性化的BmBacmid-K01629发生同源重组，修复必需基因orfl629而救活 病毒，另一端则或末端连接，或同源重组。 本专利技术所提及的重组方案，所用昆虫杆状病毒及其本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组杆状病毒无缝克隆的方法，其特征是：包括两个主要构成元件：可线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段，上述两个元件在昆虫细胞内直接重组产生重组杆状病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈健，钱月忠，费伟强，郝学敏，陈琴，
申请(专利权)人：杭州普莱柯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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