安卡拉病毒亚单位疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种安卡拉亚单位疫苗的制备方法及应用，利用杆状病毒表达系统构建重组质粒pFastBac HTB‑Penton转化DH10Bac E.coli得到正确的重组杆粒Bacmid‑Penton后转染Sf9细胞拿到重组毒Ac‑Penton表达安卡拉病毒的免疫原性基因Penton，Fiber2并进行蛋白的大量表达和纯化，蛋白表达量高，蛋白活性高，以Penton蛋白为抗原的安卡拉亚单位疫苗和以Penton+Fiber2蛋白为抗原的安卡拉混合亚单位疫苗都能对安卡拉病毒达到100％的保护率并且两种疫苗产生的抗体高，维持时间长。均能有效治疗安卡拉病，减少安卡拉病毒感染将给养殖业带来重大的经济损失。

【技术实现步骤摘要】
安卡拉病毒亚单位疫苗的制备方法及应用
本专利技术涉及疫苗制备
，具体地指一种安卡拉病毒亚单位疫苗的制备方法及应用。
技术介绍
2015年10月我国山东、安徽、河南等地爆发安卡拉病毒，此病是由腺病毒引起，主要引起肾炎、包涵体肝炎、心包积液、产蛋下降综合征等。腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚型，Ⅰ亚型不常见，Ⅱ亚型(火鸡出血性肠炎和相关病毒)，Ⅲ亚型就是近期闹的沸沸扬扬的肾炎、产蛋下降综合症、包涵体肝炎以及心包积水综合症(因其最早爆发于巴基斯坦的安卡拉地区，故又叫安卡拉疾病)。本病发生于3～6周龄的肉鸡发病鸡群多于3周龄开始死亡，4～5周龄达高峰，高峰持续期4～8天，5～6周龄死亡减少。病程8～15天，死亡率达20～80％。本病可垂直传播和水平传播。易与禽流感、新城疫、传染性法氏囊和传染性贫血病并发本病发病急骤一旦感染将给养殖业带来重大的经济损失成为危害畜牧业发展的重大疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。安卡拉病毒是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五邻体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白。五邻体是腺病毒的主要结构蛋白之一，它的多肽长452个氨基酸，参与构成病毒粒子的十二个顶点五邻体通过其RGD或LGV基序与细胞表面的整联蛋白作用，有助于腺病毒的侵入和内化。其抗体可以阻断病毒体从酸性的核内质进入细胞浆，从而使病毒感染性失活五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。因此Penton蛋白是作为安卡拉病毒的亚单位疫苗的首选。杆状病毒表达系统就是一个有力的工具，杆状病毒昆虫细胞表达系统(BaculovimsexpressionvectorsystemBEVS)是一种真核表达系统它以杆状病毒为载体通过将外源基因插入到杆状病毒基因组并且用重组病毒感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白并对蛋白进行一定程度的包装修饰折叠。到目前使用该表达系统表达的外源基因已有数千种是最具有应用前景的真核基因高效表达系统之一。随着生物技术的发展杆状病毒从单一感染昆虫细胞发展为现在的感染哺乳动物细胞它的应用从蛋白的表达、疫苗的生产拓展到表面展示、基因治疗等许多领域并且仍然处于不断改进与发展之中。作为新发病毒目前尚无商业化的安卡拉病毒疫苗进行防控。此病造成如此大的经济损失，使得安全高效的疫苗的投入市场迫在眉睫。而常用的灭活苗在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇；产生的免疫效果维持时间短，不产生局部抗体；可能产生毒性或潜在的对机体不利的免疫反应；需要多次注射，需要抗原量比较大，成本比较高。
技术实现思路
本专利技术目的是提供了一种安卡拉病毒亚单位疫苗的制备方法及应用，该疫苗以杆状病毒表达系统表达的安卡拉病毒的主要抗原Penton蛋白表达量高，蛋白活性高，Penton蛋白为抗原的安卡拉亚单位疫苗以及Penton+Fiber2蛋白为抗原的安卡拉混合亚单位疫苗都能对安卡拉病毒达到100％的保护率并且两种疫苗产生的抗体高，维持时间长。均能有效治疗安卡拉病，减少安卡拉病毒感染将给养殖业带来重大的经济损失。为实现上述目的，本专利技术提供的一种重组质粒pFastBacHTB-Penton，所述重组转移质粒pFastBacHTB-Penton是在载体pFastBacHTB的BamHI和HindⅢ两个酶切位点间插入Penton基因构建而成，其中，Penton基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种上述重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建方法，包括以下步骤：1)Penton基因的获得设计引物：Penton-F：5'-AGCGGATCCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，BamHIPenton-R：5'-GGTAAGCTTCTACTGCAAGGTCGCGGAACTC-3'；HindⅢ以安卡拉病毒的全基因组DNA为模板，进行PCR，扩增回收得到含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因；2)重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建以载体pFastBacHTB为骨架，用限制性内切酶酶切载体pFastBacHTB和含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因，用连接酶将线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因连接，得到重组质粒pFastBacHTB-Penton。作为优先方案，所述步骤1)中，PCR体系：PCR条件：94℃预变性5min，PCR循环为95℃30s，50℃退火30s68℃1min；30个循环后68℃延伸10min；所述步骤2)中，酶切体系：酶切条件：将上述体系混匀后37℃酶切反应3h。本专利技术还提供了一种重组杆状病毒Ac-Penton，所述重组杆状病毒Ac-Penton的基因组中含有权利要求1所述的重组质粒pFastBacHTB-Penton。本专利技术还提供了一种上述重组杆状病毒Ac-Penton的制备方法，包括以下步骤：1)Penton基因的获得设计引物：Penton-F：5'-AGCGGATCCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，BamHIPenton-R：5'-GGTAAGCTTCTACTGCAAGGTCGCGGAACTC-3'；HindⅢ以卡拉病毒的全基因组DNA为模板，进行PCR，扩增回收得到含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因；2)重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建以载体pFastBacHTB为骨架，用限制性内切酶酶切载体pFastBacHTB和含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因，用连接酶将线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因连接，得到重组质粒pFastBacHTB-Penton。3)重组杆粒Bacmid-Penton将重组质粒pFastBacHTB-Penton转化DH10BacE.coli感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后取少量培养液划线于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)和IPTG、X-gal的高盐LB平板培养，通过蓝白斑筛选挑取单个白色菌落PCR鉴定正确后接种含有抗生素的的LB液体培养基中，37℃220rpm/min振动培养振摇培养过夜，提取得到重组杆粒Bacmid-Penton；4)重组杆状病毒Ac-Penton获得将重组杆粒Bacmid-Penton转染sf9细胞，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，离心去除细胞碎片，收集上清即获得重组杆状病毒Ac-Penton。作为优先方案，所述步骤1)中，PCR体系：PCR条件：94℃预变性5min，PCR循环为95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30个循环后，68℃延伸10min；所述步骤2)中，酶切体系：酶切条件：将上述体系混匀后37℃酶切反应3h。本专利技术还提供了一种基于重组杆状病毒Ac-Penton制备安卡拉病毒亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：1)将重组杆状病毒Ac-Penton接种悬浮培养的昆虫细胞SF9中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒pFastBac HTB‑Penton，其特征在于：所述重组转移质粒pFastBac HTB‑Penton是在载体pFastBac HTB的BamHI和HindⅢ两个酶切位点间插入Penton基因构建而成，其中，Penton基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pFastBacHTB-Penton，其特征在于：所述重组转移质粒pFastBacHTB-Penton是在载体pFastBacHTB的BamHI和HindⅢ两个酶切位点间插入Penton基因构建而成，其中，Penton基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)Penton基因的获得设计引物：以安卡拉病毒的全基因组DNA为模板，进行PCR，扩增回收得到含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因；2)重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建以载体pFastBacHTB为骨架，用限制性内切酶酶切载体pFastBacHTB和含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因，用连接酶将线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因连接，得到重组质粒pFastBacHTB-Penton。3.一种权利要求2所述重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR体系：PCR条件：94℃预变性5min，PCR循环为95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30个循环后，68℃延伸10min；所述步骤2)中，酶切体系：酶切条件：将上述体系混匀后37℃酶切反应3h。4.一种重组杆状病毒Ac-Penton，其特征在于：所述重组杆状病毒Ac-Penton的基因组中含有权利要求1所述的重组质粒pFastBacHTB-Penton。5.一种权利要求4所述重组杆状病毒Ac-Penton的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)1)Penton基因的获得设计引物：以卡拉病毒的全基因组DNA为模板，进行PCR，扩增回收得到含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因；2)重组质粒pFastBacHTB-Penton的构建以载体pFastBacHTB为骨架，用限制性内切酶酶切载体pFastBacHTB和含有酶切位点BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因，用连接酶将线性化的pFastBacHTB和线性化的Penton基因连接，得到重组质粒pFastBacHTB-Penton。3)重组杆粒Bacmid-Penton将重组质粒pFastBacHTB-Penton转化DH10BacE.coli感受态细胞，在LB液体培养基中培养，然后取少量培养液划线于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素和IPTG、X-gal的高盐LB平板培养，通过蓝白斑筛选挑取单个白色菌落PCR鉴定正确后接种含有抗生素的的LB液体培养基中，37℃220rpm/min振动培养振摇培养过夜，提取得到重组杆粒Bacmid-Penton；4)重组杆状病毒Ac-Penton获得将重组杆粒Bacmid-Penton转染sf9细胞，4-7天后观察到细胞有明显病变，收集细胞培养液，离心去除细胞碎片，收集上清即获得重组杆状病毒Ac-Penton。6.根据权利要求5所述重组杆状病毒Ac-Penton的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR体系：PCR条件：94℃预变性5min，PCR循环为95...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，张丹，邓雪霞，马季，康超，杨影，魏燕鸣，张强，孙小美，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42