CTLA‑4抗体FAB在昆虫表达系统中的制备方法技术方案

本发明专利技术涉及CTLA‑4抗体FAB 在昆虫表达系统中的制备方法，包括：（a）将N端分别带有信号肽的Fab片段的轻链与重链的氨基酸序列的基因克隆于带有双启动子的杆状病毒表达载体内构建重组表达载体；（b）将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至昆虫细胞中，得到重组杆状病毒后进一步扩增病毒，并使用病毒感染放大培养的昆虫细胞以表达Fab蛋白，离心收集含Fab蛋白的上清产物；（c）将所得昆虫细胞表达上清首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到全人源单克隆抗体CTLA‑4单抗Fab片段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及全人源CTLA-4抗体片段在昆虫细胞/杆状病毒表达系统中的制备方法，属于生物

技术介绍
CTLA-4的全称叫做细胞毒性T细胞相关蛋白-4(CytotoxicTlymphocyteassociatedprotein-4)，它是T细胞表面表达的一类共刺激分子(co-stimulatorymolecule)。与CD28的功能类似，在T细胞激活过程中，CTLA-4能够与抗原呈递细胞(Antigenpresentingcell,APC)表面的CD80/CD86特异性结合来激活下游信号。研究发现，T细胞中主要表达CTLA-4的细胞为调节性T细胞(Treg)，是一类可以负向调节细胞免疫的T细胞；在缺失CTLA-4受体时，小鼠表现出T细胞过度活化伴随严重的自身免疫病。以上结果可以得出，Treg需要通过CTLA-4行使其功能。另外，CTLA-4也在conT细胞中有表达，其作用是抑制T细胞激活的信号传递。CTLA-4FAB片段是人单克隆抗体Ipilimumab(易普利姆玛)的重链和轻链经二硫键结合的二聚物，是属于免疫治疗癌症的潜在重磅药物之一。Fab是IgG分子的抗原结合片段，是由Fd片段与轻链通过二硫键结合形成的异二聚合体，因其相对分子质量小、有高度确定的完整性结构和免疫原性低等优点成为IgG类抗体生产和改造的首选。由于Fab片段没有Fc段，不需要进行复杂的糖基化和翻译后修饰，所以不需要通过哺乳动物细胞系统来生产。而Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统与其他真核表达系统相比有许多优势：能高水平表达外源基因；大多数表达的重组蛋白可溶；能进行翻译后的加工修饰：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除等；较容易分离纯化；昆虫细胞悬浮生长易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在昆虫细胞/杆状病毒表达系统中分泌共表达获得重组CTLA-4抗体Ipilimumab的Fab片段的制备方法。本专利技术人经研究发现，通过利用昆虫细胞作为宿主进行表达，可获得具有生物活性的重组CTLA-4抗体Fab蛋白。在此，本专利技术提供一种全人源单克隆抗体CTLA-4单抗Fab片段的制备方法，包括：(a)将N端分别带有信号肽的Fab片段的重链(heavychain，Hc)与轻链(lightchain，Lc)的氨基酸序列的基因克隆于带有双启动子的杆状病毒表达载体(优选为pFastBacT1)内构建重组表达载体；(b)将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至昆虫细胞中，得到重组杆状病毒后进一步扩增病毒，并使用病毒感染放大培养的昆虫细胞以表达Fab蛋白，离心收集含Fab蛋白的上清产物；(c)将所得昆虫细胞表达上清首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到全人源单克隆抗体CTLA-4单抗Fab片段。本专利技术运用基因工程等技术手段，将带有信号肽(例如AcNPVgp64)的Fab片段的重链与轻链分别克隆至杆状病毒载体(例如pFastBacT1)中，获得重组质粒，将重组质粒转座到感受态细胞(例如DH10Bac)中获得重组BacmidDNA，转染昆虫细胞(例如Sf9)获得重组杆状病毒，利用病毒感染昆虫细胞，分泌共表达目的蛋白，离心收集含目的蛋白的上清产物。再进行色谱柱纯化，得到有生物活性的CTLA-4蛋白。经本专利技术方法获得的全人源单克隆抗体CTLA-4片段经分析显示纯度较高，且能特异性结合CTLA-4，其抑制效果与标准品Ipilimumab相似，说明本专利技术方法Fab片段保留了标准品Ipilimumab具备的抗原结合性和特异性；而该Fab片段分子量低易靶向作用于病灶，另外昆虫细胞悬浮生长易放大培养，该Fab片段可以在昆虫细胞中大规模表达生产，易于分离纯化。本专利技术中，选用昆虫细胞杆状病毒表达载体pFastBacT1共分泌表达，能容纳大分子的插入片段，表达多种外源基因并可以高效并大量表达外源基因。通过添加外分泌信号肽可以分泌共表达Fab蛋白于昆虫细胞上清中，利用胞外的氧化环境，能够指导Fab重链和轻链间二硫键的形成。较佳地，在步骤(a)中，所述重组表达载体为pFastBacT1，包括：两个启动子、复制子、多克隆酶切位点、和两个终止子。较佳地，在步骤(a)中，Fab片段的Lc与Hc的N端的信号肽为外分泌信号肽AcNPVgp64。较佳地，Fab片段的重链和轻链的启动子皆为多角体基因启动子(polyhedrin(PH)promoter)。较佳地，在步骤(b)中，所述感受态为DH10Bac。较佳地，转座菌斑筛选方法为蓝白斑筛选法。较佳地，在步骤(b)中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。较佳地，转染试剂可为脂质体cellfection，另外，转染步骤中所用培养基可为Sf-900TMIISFM培养基。较佳地，在步骤(b)中，所述重组杆状病毒P0扩增病毒P1，即将200μL重组杆状病毒P0加入100mL细胞密度为2×106cells/ml的Sf9昆虫细胞中，37℃摇床培养96h后离心获得病毒P1。在步骤(b)中放大培养细胞并表达所用的培养基为ESFAF培养基。在步骤(c)中，所述纯化依次包括：使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液；以及亲和层析和分子筛介质层析。在步骤(c)中，所述亲和柱层析的亲和层析介质为ProteinA。在步骤(c)中，所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex75。附图说明图1为CTLA-4抗体片段重组表达载体图谱；图2为ProteinA亲和纯化后的FabSDS-PAGE电泳图；其中的图A为在非还原条件下电泳所得结果，图B为还原条件下电泳所得结果；Fab为IgG1抗原结合区Hc和Lc二聚体，还原条件下为23kD两条电泳条带，非还原条件下在47kD处有单一电泳条带；图3为分子筛层析纯化后的FabSDS-PAGE电泳图，其中的图A为在非还原条件下电泳所得结果，图B为还原条件下电泳所得结果；图4为分子筛层析纯化并浓缩后的FabSDS-PAGE电泳图，表明获得的Fab抗体片段具有较高纯度。具体实施方式以下结合附图和下述实施方式进一步说明本专利技术，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。本专利技术运用基因工程等手段，利用杆状病毒作为表达载体，利用昆虫细胞作为宿主，表达全人源单克隆抗体Ipilimumab的Fab片段(在本文中，亦简称重组CTLA-4抗体片段、CTLA-4抗体Fab片段、CTLA-4抗体片段、CTLA-4片段、CTLA-4蛋白、或Fab片段等)。在一个示例中，本专利技术的制备方法包括：将分别带有AcNPVgp64信号肽的Fab片段的重链和轻链克隆至杆状病毒载体pFastBacT1中，构建重组表达载体，将重组质粒转座到感受态细胞DH10Bac中获得重组BacmidDNA并转染至Sf9昆虫细胞中获得重组杆状病毒，利用病毒感染sf9昆虫细胞，分泌共表达Fab目的蛋白，离心获得含目的蛋白的上清产物；对所得的蛋白进行色谱柱纯化，得到CTLA-4蛋白。以下，示例性地说明本专利技术的制备方法。(1)重组表达载体的构建分别合成带有信号肽的Fab片段的重链与轻链的基因，克隆于带有双启动子的pFastBacT1载体内，构建CTLA-4抗体片段重组表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用昆虫细胞/杆状病毒表达系统制备重组CTLA‑4 抗体Fab片段的方法，其特征在于，包括：（a）将N端分别带有信号肽的Fab片段的轻链与重链的氨基酸序列的基因克隆于带有双启动子的杆状病毒表达载体内构建重组表达载体；（b）将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至昆虫细胞中，得到重组杆状病毒后进一步扩增病毒，并使用病毒感染放大培养的昆虫细胞以表达Fab蛋白，离心收集含Fab蛋白的上清产物；（c）将所得昆虫细胞表达上清首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到全人源单克隆抗体CTLA‑4单抗Fab片段。

【技术特征摘要】
1.一种使用昆虫细胞/杆状病毒表达系统制备重组CTLA-4抗体Fab片段的方法，其特征在于，包括：（a）将N端分别带有信号肽的Fab片段的轻链与重链的氨基酸序列的基因克隆于带有双启动子的杆状病毒表达载体内构建重组表达载体；（b）将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至昆虫细胞中，得到重组杆状病毒后进一步扩增病毒，并使用病毒感染放大培养的昆虫细胞以表达Fab蛋白，离心收集含Fab蛋白的上清产物；（c）将所得昆虫细胞表达上清首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到全人源单克隆抗体CTLA-4单抗Fab片段。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，Fab片段的重链和轻链的N端的信号肽皆为外分泌信号肽AcNPVgp64。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，Fab片段的重链和轻链的启动子皆为多角体基因启动子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，所述重组表达载体为pFastBacT1，包括：两个启动子、复制子、多克隆酶切位点、和两个终止子。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，汪俊，陈春麟，周南梅，
申请(专利权)人：上海美迪西生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31