本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，特别是涉及一种固化酶切制备Fab抗体的方法及其用途。本发明专利技术提供一种固化酶切制备Fab抗体的方法，包括如下步骤：1）固化酶的制备方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶与活化偶联填料充分偶联；2）固化酶酶切：取2H4抗体5mg，与5ml含100μl固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2消化缓冲液混合、孵育，酶浓度为0.05mg/ml；3）酶切后Fab抗体分离纯化即得Fab抗体。本发明专利技术建立的Fab抗体制备方法具有酶切速度快、分离简单、固化酶可以反复使用，不需要昂贵的全自动化设备，试剂成本低廉等优势，适合在国内普及推广。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及免疫分析医学领域，特别是涉及一种固化酶切制备Fab抗体的方法及其用途。本专利技术提供一种固化酶切制备Fab抗体的方法，包括如下步骤：1）固化酶的制备方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶与活化偶联填料充分偶联；2）固化酶酶切：取2H4抗体5mg，与5ml含100μl固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2消化缓冲液混合、孵育，酶浓度为0.05mg/ml；3）酶切后Fab抗体分离纯化即得Fab抗体。本专利技术建立的Fab抗体制备方法具有酶切速度快、分离简单、固化酶可以反复使用，不需要昂贵的全自动化设备，试剂成本低廉等优势，适合在国内普及推广。【专利说明】_种固化酶切制备Fab抗体的方法及其应用
本专利技术涉及免疫分析医学领域，特别是涉及一种固化酶切制备Fab抗体的方法及 其用途。
技术介绍
单克隆抗体技术是1975年英国科学家Milstein和Kohler所专利技术，目前广泛应用 于临床治疗及诊断领域，是免疫学领域的重大突破。鼠源性单克隆抗体经常需要切除其Fc 段以减少免疫治疗过程中的人抗鼠反应（HAM)及临床检测时导致的假阳性干扰。木瓜蛋 白酶（papain)能水解IgG的部位是在铰链区二硫键连接的2条重链的近N端，裂解后可得 到三个片段，2个相同片段称为抗原结合片段（fragment antigen binding，Fab)及1个可 结晶片段（fragment crystallizable，Fe) 〇 抗体经木瓜蛋白酶酶切后需要分离Fab片段及Fe片段，并除去加入的木瓜蛋白酶 才能使用。目前，常用的方法是通过Protein G/A除掉Fc段后采用凝胶过滤的方式通过分 子量大小进行分离，该方法比较费时，一次只能处理l_2ml样本，不适于大规模制备。也有 报道通过Protein A和Protein G不同亲和部位不同进行快速亲和纯化分离，但该方法并 不适用于不同抗体亚类的鼠单克隆抗体。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术通过将酶偶联于活化的NHS-S印harose微 球，然后将其加入到抗体及酶切缓冲中微震荡酶切，酶切结束后离心分离微球并proteinA/ G -步既可以分离酶切后的Fab抗体，以提供一种固化酶切制备Fab抗体的方法及其用途， 用于解决现有技术中的问题。 为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种固化酶切制备Fab抗 体的方法，包括如下步骤： 1)固化酶的制备方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶与活 化偶联填料充分偶联； 2)固化酶酶切：取2H4抗体5mg，与5ml含100 μ 1固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2 消化缓冲液混合，于37°C下孵育2h，酶浓度为0. 05mg/ml ; 3)酶切后Fab抗体分离纯化即得Fab抗体。 优选的，所述步骤1中，活化的微球具体为NHS-activated Sepharose 4Fast Flow 微球。 优选的，所述步骤2酶切后，用TriS-HCl (I. 0m〇l/L，pH 8. 0)将抗体酶切产物pH 调节到7. 5?8. 0。 优选的，所述步骤3中分离纯化的具体条件包括如下步骤： (1)用 Tris-HCl (I. 0mol/L，pH 8. 0)将抗体酶切产物 pH 调节到 7. 5 ?8. 0。 (2)将抗体酶切产物通过空白层析柱收集流出液，滤去固定化酶并将其回收。 (3)将流出液通过蛋白A柱，收集流出蛋白记为蛋白PI。 (4)使用PBS缓冲液充分平衡蛋白A柱后，用HCl-甘氨酸（0. lmol/L，Ph 2. 7)洗脱 柱子，收集洗脱蛋白记为蛋白P2,用Tris-HCl (I. Omol/L，pH 8. 0)将P2的pH调节到7. 5? 8. 0〇 (5)将所得蛋白透析于PBS中。 本专利技术第二方面提供所述固化酶切制备Fab抗体的方法在Fab抗体制备领域的用 途。 本专利技术的内容包括：1)固化酶的制备方法；2)固化酶酶切抗体使用的缓冲体系； 3)固化酶酶切抗体的方法；以及4)酶切后Fab抗体的分离。进一步，根据本专利技术制备固 化酶的方法及其应用包括以下步骤：1)配置酶溶液并将其偶联于活化的NHS-sepharose微 球；2)配置酶切缓冲液并加入抗体及微球；3)将酶切混合物置于37°C震荡酶切30-60分 钟；以及4)proteinA/G分离酶切后的Fab抗体。 本专利技术建立的Fab抗体制备方法具有酶切速度快、分离简单、固化酶可以反复使 用，不需要昂贵的全自动化设备，试剂成本低廉等优势，适合在国内普及推广。 【专利附图】【附图说明】 图1显示为本专利技术固定化法抗体酶切结果图。 图2显示为本专利技术固定化木瓜蛋白酶偶联电泳结果。 图3显示为本专利技术抗原免疫亲和柱偶联电泳结果。 图4显示为间接ELISA法检测Fc段。 图5显示为间接ELISA法检测Fab片段免疫活性。 【具体实施方式】 以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。 在进一步描述本专利技术【具体实施方式】之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和 科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本 专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本专利技术。 除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；f本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固化酶切制备Fab抗体的方法，包括如下步骤：1)固化酶的制备方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶与活化偶联填料充分偶联；2)固化酶酶切：取2H4抗体5mg，与5ml含100μl固定化木瓜蛋白酶的EDTA‑Na2消化缓冲液混合、孵育，酶浓度为0.05mg/ml；3)酶切后Fab抗体分离纯化即得Fab抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吉权，
申请(专利权)人：重庆乾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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