一种提高胰岛素前体产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过分子生物学手段将人工合成的胰岛素前体通过双酶切和毕赤酵母表达载体pPIC9K相连接，构建重组菌株，通过G418抗性筛选获得高拷贝重组的含胰岛素前体的工程菌P.pastoris GS115‑PI(CL012)，并在该重组菌种共表达SNC2和Sso2基因，通过高密度发酵使得菌株的胰岛素前体产量达到78mg/L，比菌株CL012的产量提高47％。

【技术实现步骤摘要】
一种提高胰岛素前体产量的方法
本专利技术涉及一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程

技术介绍
近年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，成为威胁人民健康的重大社会问题。胰岛素类药物是治疗糖尿病的特效必需药，但是有限的生产和巨大的需求之间的矛盾，迫切需要我们尽快找到有效策略，提高胰岛素的产量。目前人们更多地采用大肠杆菌和酵母表达系统发酵生产重组人胰岛素前体，然后加工成有活性的重组人胰岛素。如：礼来公司利用大肠杆菌，采用16步发酵技术生产重组人胰岛素；诺和诺德公司，使用的是酿酒酵母生产中效胰岛素。大肠杆菌和酿酒酵母作为生产人胰岛素的表达系统存在着一些问题如大肠杆菌表达系统存在的问题：(1)由于大肠杆菌会产生较多自身蛋白酶，特别容易降解人胰岛素前体类似的小蛋白；(2)过表达产物会以包涵体形式在细胞质中产生，需要复杂的变性、复性加工过程，才能转变成有活性的胰岛素，增加后来处理的难度和复杂程度。酿酒酵母表达系统存在的问题：(1)酿酒酵母表达载体传代不稳定；(2)分泌表达的产物常常过度糖基化，且糖蛋白的核心寡聚糖链含α-1,3聚糖连接头，会增加产物的抗原性，不利于治疗。(3)酿酒酵母大规模发酵过程中会产生乙醇，很难进行高密度发酵培养。由于毕赤酵母表达外源蛋白时具有以下优点：(1)表达载体能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(2)毕赤酵母具有目前最强，调控最严格启动子之一的AOX1；(3)对表达的蛋白进行翻译后加工和修饰，不会出现过度糖基化的现象；(4)可以利用简单的基础盐培养基进行高密度发酵，利于工业上的扩大生产。毕赤酵母(Pichiapastoris)由于具有表达异源蛋白的较多优点，有望实现人胰岛素前体的高效表达。然而，由于毕赤酵母表达异源蛋白的过程中，有许多限速步骤限制异源蛋白的分泌。因此，一种调控限速过程，提高毕赤酵母中异源表达胰岛素前体(PI)的分泌能力的方法对于提高胰岛素产量具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种胰岛素前体，其氨基酸序列如SEQIDNO,2所示。本专利技术的第二个目的是提供编码所述胰岛素前体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第三个目的是提供一种产胰岛素前体的重组菌，是以毕赤酵母为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQIDNO.1所示基因。在本专利技术的一种实施方式中，还表达SNC2基因或Sso2基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述SNC2基因序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述SNC2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述Sso2基因序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述Sso2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第四个目的是提供一种生产胰岛素前体重组菌的构建方法，所述方法是以pPIC9K为载体，将SEQIDNO.1所示的编码胰岛素前体的基因与载体连接，在毕赤酵母中重组表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pPIC9K，所述毕赤酵母为P.pastorisGS115。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌还表达SEQIDNO.3所示的SNC2基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌还表达SEQIDNO.5所示的Sso2基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述SNC2基因以pPICZα为载体进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)以pPIC9K为载体，将SEQIDNO.1所示基因与载体连接，在毕赤酵母P.pastorisGS115中进行表达；(2)以pPICZα为载体，将SEQIDNO.3所示基因与载体连接，在步骤(1)的毕赤酵母中重组表达SEQIDNO.3所示SNC2基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述Sso2基因以pPICZα为载体进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)以pPIC9K为载体，将SEQIDNO.1所示基因与载体连接，在毕赤酵母P.pastorisGS115中进行表达；(2)以pPICZα为载体，将来源于面包酵母的编码Sso2的基因与所述载体连接，在毕赤酵母中重组表达。本专利技术的第五个目的是提供应用所述重组菌生产胰岛素前体的方法，所述方法是将所述重组菌培养至OD600＝2.0-6.0，加入甲醇诱导胰岛素前体的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD600为2.0-6.0，加入终浓度为1mL/L的甲醇后，在30℃下进行诱导24-96h。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株生长培养条件是：pH5.5，温度为30℃，培养时间24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株诱导条件是：pH5.5，温度为30℃，诱导时间96h。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株生长及诱导都在摇床中进行，摇床转速为200～250r/min。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株使用的诱导剂是浓度为1mL/L的甲醇。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是进行高密度发酵，以提高胰岛素前体产量的方法，所述方法是将所述重组菌的菌液接种于YPD培养基，200～250r/min，30℃培养20-24h；然后以按体积10％的接种量转接到装液量30～60％的发酵罐中进行发酵，控制pH为5.2～5.8，当甘油耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加甘油(控制溶氧大于10％)，，以16～20mL/(L·h)的速率流加甘油，4-6h后停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体1.5～3h后，开始流加甲醇，并通过调节其流速维持培养基中的甲醇浓度在2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，甘油流加速度为18.15mL/(L·h)，4-6h后流加停止，待甘油再次耗尽并饥饿菌体2h后，开始流加甲醇，并通过调节其流速维持培养基中的甲醇浓度在2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，用浓度为30％的氨水控制pH为5.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株的种子培养条件是：温度30℃，转速200r/min，培养时间是24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株的甘油生长阶段的培养条件是：pH5.5，温度30℃，转速400-600r/min，培养时间是18-24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株的甘油流加阶段的培养条件是：pH5.5，温度30℃，转速700r/min，培养时间是4-6h。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株的甲醇诱导阶段的培养条件是：pH5.5，温度25℃，转速800r/min，培养时间是96h。本专利技术还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域中制备含胰岛素前体的产品中的应用。有益效果：1、本专利技术是使用人工合成的胰岛素前体基因构建重组菌株，将来源于面包酵母的SNC2和Sso2基因共表达于含胰岛素前体基因的重组菌株，通过SNC2和Sso2基因所表达的蛋白具有将异源蛋白从高尔基体运输到质膜的作用，来提高毕赤酵母中胰岛素前体从高尔基体到质膜的运输，增加胰岛素前体的表达，为工业化应用奠定基础。2、利用高密度发酵使胰岛素前体的产量达到53mg/L，含SNC2的重组菌株CL0121的产量达到78mg/L，比出发菌株CL001的产量提高47％；含Sso本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素前体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素前体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.编码权利要求1所述胰岛素前体的基因。3.一种产胰岛素前体的重组菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQIDNO.1所示基因。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，还表达SNC2基因和/或Sso2基因。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述SNC2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述Sso2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。6.一种生产胰岛素前体的重组菌的构建方法，其特征在于，以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQIDNO.1所示的编码胰岛素前体的基因。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，梁晨晨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32