一种AFP、GP73、PIVKA-Ⅱ联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ的检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明专利技术所述检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明专利技术所提供试剂盒首次将AFP、GP73和PIVKA-Ⅱ通过荧光微球免疫层析技术进行检测，兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种AFP、GP73、PIVKA-Ⅱ联合检测试剂盒及其制备方法和用途。
技术介绍
甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)是胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种糖蛋白，随着胎儿发育和出生后年龄的增长，血液中AFP水平逐渐下降，成人血清AFP浓度的参考区间为1-20μg/L。AFP是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的敏感特异的标志物，血清AFP浓度超过400μg/L持续4周或者200-400μg/L持续5周以上，高度怀疑肝细胞肝癌；同时血清AFP水平还有可用肝癌的大小判断、肝癌的疗效评估和预后判断。但据统计，大约20％-30％的肝细胞肝癌患者血清AFP水平不高；部分良性肝病，包括急性肝炎、慢性肝炎和大面积的肝坏死，也会有血清AFP的升高。因此，用血清AFP作为肝细胞肝癌的标志物存在一定程度的假阳性和假阴性。高尔基体糖蛋白-73(GolgiProtein 73,GP73)又称Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgiphosphoprotein2,GOLPH 2)，其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中浓度升高，而在肝细胞肝癌病人血清中升高更加明显，和正常人或良性肝病病人之间呈显著差异。有研究表明，血清GP73用于肝癌的诊断，优于血清AFP检测。据文献报道，GP73检测肝癌的灵敏度为69％,特异性为75％。对于早期肝癌的诊断,GP73的敏感性为62％,而AFP敏感性仅为25％。AFP水平低于20μg/L的肝癌患者中,有57％的人群GP73水平显著升高。这表明，GP73的应用能够大大提高对AFP阴性的肝癌患者的检出率。维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist-II，PIVKA-Ⅱ)，又叫脱-γ-羧基凝血酶原(Des-gamma-carboxy prothrombin，DCP)或异常凝血酶原，1984年首次被认定为原发性肝癌的标志物。肝细胞肝癌患者血清中PIVKA-Ⅱ浓度水平远高于肝硬化和转移性肝癌患者，而且其血清浓度变化和患者肝细胞癌的动态变化(手术、治疗和复发等)相关。后来的研究证实，PIVKA-Ⅱ和AFP检测可以互为补充，二者的联合检测可以将肝细胞肝癌的诊断率提高到84％，仅大约16％的肝细胞肝癌患者两者都呈阴性结果。目前PIVKA-Ⅱ检测已被列入《日本肝癌学会肝癌诊疗规范2009年版》中，用于肝细胞癌高危人群的筛查及原发性肝癌的辅助诊断；我国卫生部发布的《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》中用于肝细胞癌辅助诊断的标志物也包括PIVKA-II。综上，AFP是经典的肝细胞肝癌的生化标志物，GP73和PIVKA-Ⅱ是新型肝癌标志物的典型代表。相对而言，GP73的敏感性更高，而PIVKA-Ⅱ的特异性更好，三种指标单独应用时都存在一定程度的假阴性和假阳性，如果通过恰当的方式和手段，同时联合检测三项指标，互为补充，将有助于进一步降低肝细胞肝癌临床诊断的假阴性和假阳性，提高这些标志物对肝细胞肝癌的诊断性能，更好地为临床和患者服务。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ的检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ的检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的金标垫上包含甲胎蛋白AFP抗体，所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的金标垫上包含高尔基体糖蛋白-73GP73抗体，所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测试纸卡的金标垫上包含维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗体，所述各硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋白-73GP73抗体和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗体采用荧光微球标记。优选的，各个金标垫上的抗体采用180nm荧光微球标记，EX(nm)＝650/Em(nm)＝670，具有信号受背景干扰小，检测灵敏度高，结果重复性好的优点。优选的，所述底板为PVC底板。优选的，所述各硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。优选的，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的检测线上包被有甲胎蛋白AFP抗体；所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的检测线上包被有高尔基体糖蛋白-73GP73抗体；所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测试纸卡的检测线上包被有维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗体。每个检测卡中金标垫上的抗体与检测线上的抗体可以是相同的抗体，也可以是不同的抗体。优选的，各质控线上包被羊抗鼠抗体。优选的，所述各样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为20-200mM。优选的，本专利技术所述的各金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为5-50mM。优选的，所述缓冲液还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为10～50g/L。优选的，所述缓冲溶液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自S-19TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13TRITON X-45、S-14TRITON X-100、S-15TRITON X305中的任意一种或多种的组合，所述表面活性剂的浓度为10～50g/L。优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本专利技术所述的各金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘...

【技术保护点】
一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白‑73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂‑II诱导产生的蛋白PIVKA‑Ⅱ的检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基体糖蛋白‑73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂‑II诱导产生的蛋白PIVKA‑Ⅱ检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的金标垫上包含甲胎蛋白AFP抗体，所述高尔基体糖蛋白‑73GP73检测试纸卡的金标垫上包含高尔基体糖蛋白‑73GP73抗体，所述维生素K缺乏或拮抗剂‑II诱导产生的蛋白PIVKA‑Ⅱ检测试纸卡的金标垫上包含维生素K缺乏或拮抗剂‑II诱导产生的蛋白PIVKA‑Ⅱ抗体，所述各硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋白‑73GP73抗体和维生素K缺乏或拮抗剂‑II诱导产生的蛋白PIVKA‑Ⅱ抗体采用荧光微球标记。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导
产生的蛋白PIVKA-Ⅱ的检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基
体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检
测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的
样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的金标垫上包
含甲胎蛋白AFP抗体，所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的金标垫上包含高尔基
体糖蛋白-73GP73抗体，所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测
试纸卡的金标垫上包含维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗体，所述各
硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体
糖蛋白-73GP73抗体和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗体采用荧
光微球标记。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各硝酸纤维素膜上，检测线位于离加
样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的检测线
上包被有甲胎蛋白AFP抗体；所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的检测线上包被
有高尔基体糖蛋白-73GP73抗体；所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-
Ⅱ检测试纸卡的检测线上包被有维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ抗
体。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，各质控线上包被羊抗鼠抗体。
5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲
液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓
冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为20-200mM。
6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各金标垫采用缓冲液处理，...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘能科，
申请(专利权)人：重庆乾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85