抗CD20抗体利妥昔单抗的稳定化制造技术

本发明专利技术提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法以及在诊断与治疗动物疾病方面的用途，所述疾病包括人类淋巴瘤、白血病和自体免疫性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供经分离稳定的抗CD20抗体和其制造方法以及在诊断与治疗动物疾病方面的用途，所述疾病包括人类淋巴瘤、白血病和自体免疫性。【专利说明】抗CD20抗体利妥昔单抗的稳定化
技术介绍
利妥昔单抗（Rituximab)(也称为 IDEC-C2B8、RITUXAN、MABTHERA)是嵌合抗 CD20 单克隆抗体，其用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤（Non-HodgkiY s lymphoma)、慢性淋巴细胞性 白血病、类风湿性关节炎和韦格纳氏肉芽肿病（Wegener' s granulomatosis)(显微镜下 多血管炎的一种形式）。CD20是在人类B细胞活化期间参与跨膜Ca2+传导和细胞周期进程 的调节的B淋巴细胞特异性细胞表面分子。CD20首先通过骨髓中的人类前B细胞表达，在 Ig重链重组之后显著表达，其中表达持续到浆细胞分化为止。⑶20在90% B细胞非霍奇 金氏淋巴瘤的表面上表达，但未在造血干细、祖B细胞、正常浆细胞或正常非造血组织上发 现。CD20不从细胞表面脱落并且未在循环中发现游离的CD20抗原。基于体外研究，当前认 为利妥昔单抗Fc结构域补充免疫效应物功能以介导B细胞溶解。 抗体是通过免疫系统产生的用于鉴别和中和例如病毒和细菌等外来病原体的蛋 白质分子。由于其极好的结合敏感性和特异性，所以抗体是具有各种治疗和诊断用途的有 价值的试剂。抗原是刺激体内合成抗体的分子。当结合到抗原时，抗原可以活化多个可以 用于攻击赘生性或自体免疫性B细胞的过程，包括例如锚定补体、吞噬抗原携带细胞和直 接细胞介导的细胞毒性。 然而，与大部分蛋白质分子的情况一样，抗体需要维持在pH、温度和溶剂条件的狭 窄范围内以保持化学和生物稳定性。此外，由于赋予每种抗体其独特的特异性的氨基酸序 列方面的差异，单独的抗体在稳定性方面差别很大。近来已经描述了可以增强抗体稳定性 同时维持其抗原结合活性的方法和组合物（参见例如，美国专利申请第13/002013号；公告 号20110130324)。治疗性抗体的这种稳定可以改善血清半衰期、降低剂量要求、减少副作 用、改善存放期并降低运送与储存成本。 因此，仍然存在对包括利妥昔单抗在内的所有治疗性抗体的稳定形式的长期需 求。
技术实现思路
本专利技术提供经分离稳定的抗CD20抗体，其中（a)所述经分离稳定的抗CD20抗体 轻链氨基酸序列包含SEQ ID N0 :1或包含具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO :1 的变异体：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F 和 A79P ; (b) 所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或包含具有以下氨基酸 序列变化中的一或多者的SEQ ID N0 :2的变异体：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、 E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、 附090、41130、￥2631^、￥277142791^和￥3121 ;以及（(：）其中所述经分离稳定的抗〇)20抗体 轻链氨基酸序列包含（a)中所列举的SEQ ID N0 :1中的所述氨基酸序列变化中的至少一 者，或者所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含（b)中所列举的SEQ ID N0 :2中的 所述氨基酸序列变化中的至少一者。所述经分离稳定的抗CD20抗体和其单独的免疫球蛋 白轻链和重链相比于"野生型抗CD20抗体"和其相应单独的免疫球蛋白轻链和重链是稳定 的，其中所述"野生型抗CD20抗体"是指具有轻链（SEQ ID NO :1)和重链（SEQ ID NO :2) 序列（这是基于最初在美国专利第5, 843, 439号中所报导的利妥昔单抗序列，但在本文中 包括重链序列的两个校正）的抗体。 本专利技术还提供经分离核酸，其编码免疫球蛋白重链或轻链或两者，其包含由本发 明提供的所述稳定的抗CD20抗体。本专利技术提供制造所述稳定的抗CD20抗体的方法。因此， 本专利技术提供包含表达所述稳定的抗CD20抗体的免疫球蛋白重链和轻链中的一者或两者的 载体的细胞。 本专利技术假设根据本专利技术的经分离稳定的抗CD20抗体包括（不限于）呈以下形式 的抗体：完全抗体、Fv片段、单链可变区（ScFv)抗体、单克隆抗体、Fab抗体片段、Fat/抗 体片段或Fab' 2 Fab抗体片段。 本专利技术进一步提供治疗患者中的疾病的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量 的所述稳定的抗CD20抗体中的任何一或多者。在优选实施例中，本专利技术提供用所述稳定的 抗CD20抗体来治疗非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、类风湿性关节炎、韦格纳 氏肉芽肿病和显微镜下多血管炎的方法。 此外，本专利技术提供定量检测患者或生物样本中的CD20多肽的方法，其包含向所述 患者投与或使所述样本接触诊断有效量的由本专利技术提供的稳定的抗CD20抗体。 【专利附图】【附图说明】 图1描绘不具有信号序列的野生型抗⑶20抗体轻链氨基酸序列SEQ ID N0 :1。 图2描绘不具有信号序列的野生型抗⑶20抗体重链氨基酸序列SEQ ID NO :2。序 列是基于由美国专利第5, 843, 439号揭示的抗⑶20序列，其中两个序列校正通过加单下划 线和加双下划线示出。 图3描绘具有信号序列的野生型抗⑶20抗体轻链氨基酸序列SEQ ID N0 :3。 图4描绘具有信号序列的野生型抗⑶20抗体重链氨基酸序列SEQ ID NO :4。 图5描绘野生型和变异体抗CD20抗体的毛细管差示扫描热量测定分析的结果。野 生型抗⑶2认定为样品RW004。样品RW005-009由稳定的变异体组成。序列变化和^值示 出在表8中。 图6描绘蛋白质A结合热挑战分析的结果。 【具体实施方式】 本专利技术涉及具有增强的稳定性的某些CD20结合抗体、所述抗体的产生和所述抗 体的用途。 定义 "经分离"和"经纯化"在本文中可互换地使用并且是指呈某种状态的分子，其中所 述分子与例如蛋白质、核酸、脂质和多糖等其它生物分子实质上分离。这是相比于此类分子 的正常体内状态，在正常体内状态中，所述分子存在于大量其它分子的存在下。 如本文中所用，术语"稳定的"、"稳定的蛋白质"和"稳定的多肽"在本文中可互 换地使用并且是指相比于野生型蛋白质（即，不具有所述氨基酸变化的蛋白质），已经产 生了致使蛋白质对例如热、冷、振动、张力等条件更具有抗性的氨基酸变化的蛋白质，所述 条件倾向于降低蛋白质的正常功能。举例来说，蛋白质的稳定性与其去折叠的吉布斯自由 能AGu有关，所述AGu与温度相关。大部分蛋白质的稳定性随温度降低；随着温度升高， AGu减小并在平衡时变为零，其中折叠和去折叠蛋白质的浓度相同。此时，所述温度视为 "解链温度"(Tm)。可以使用蛋白质在荧光染料存在下的热去折叠来评定蛋白质^。虽然不 是平衡方法，但是可以使用所述技术根据相对T m对蛋白质进行排序。（此外参见例如，尼森 F. H. (Niesen F.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离稳定的抗CD20抗体，其中a.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：1：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P；b.所述经分离稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或具有以下氨基酸序列变化中的一或多者的SEQ ID NO：2：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L和V312I；以及c.所述经分离稳定的抗CD20抗体轻链氨基酸序列包含(a)中所列举的SEQ ID NO：1中的所述氨基酸序列变化中的至少一者或所述稳定的抗CD20抗体重链氨基酸序列包含(b)中所列举的SEQ ID NO：2中的所述氨基酸序列变化中的至少一者。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗斯玛丽·威尔顿，
申请(专利权)人：医用蛋白国际有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US