本发明专利技术以混合多肽与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞系5E3-9，微生物保藏号CCTCC NO:C2013135。用获得的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可在制备基因C型鸭病毒性肝炎抗体检测试剂方面得到广泛的应用。用获得抗体研制的ELISA试剂盒特异性强，稳定性好，可应用于基因C型鸭甲肝病毒抗体的检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术以混合多肽与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞系5E3-9，微生物保藏号CCTCC?NO:C2013135。用获得的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可在制备基因C型鸭病毒性肝炎抗体检测试剂方面得到广泛的应用。用获得抗体研制的ELISA试剂盒特异性强，稳定性好，可应用于基因C型鸭甲肝病毒抗体的检测。【专利说明】—种基因C型鸭甲肝病毒的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的涉及一种能够治疗鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法及制备抗体的用途，属于基因C鸭病毒性肝炎防控领域。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(Duckviral hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus, DHV)引起的一种主要危害3周龄以内雏鸭的急性、高度致死性传染病。DHV包括小RNA病毒科和星状病毒科成员，而小RNA病毒科的DHV又被命名为鸭甲肝病毒(duckhepatitis Avirus，DHAV)，根据基因型结构的差异，DHAV又分为基因A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)和C型(DHAV-C)三种基因型。其中在我国流行的传统I型DHV为基因A型DHAV，台湾地区新发的为基因B型，而近年来，韩国样新型或称基因C型的DHAV在我国的地区分布已较为广泛，基因A型和C型DHAV在我国许多养鸭地区的同时流行是我国许多鸭场针对传统的I型DHV采取措施后仍发生DVH的根本原因。然而，目前还没有单克隆抗体用于基因C型DHAV检测及治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤:(I)合成多肽 TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR, NLFESKLTPY, TTHQIETVTI, PEIPKYDGPI, SSFKQDVMDQ, MDQIQSPSTV, PVLEIQPffGV, GVARMRAYTA,每条多肽的 C-端加上半胱氨酸残基；`(2)将上述多肽混合并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；(3)将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠:抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫I次，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔I周加强免疫一次，第4次增强免疫注射抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合；(4)杂交瘤细胞株的制备与筛选:按常规的细胞融合技术融合:取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养；以步骤(1)合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%，获得稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株；(5)取6~8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7~10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，_80°C冻存得到单克隆抗体的粗品；(6)粗品经纯化得到单克隆抗体，所述单克隆抗体为分子量为50KD左右为重链蛋白与分子量为25KD左右轻链蛋白的组合，为IgG2亚类。采用本专利技术的方法所制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可以广泛应用于鸭甲肝病毒的治疗。微生物信息杂交瘤细胞株5E3-9保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC N0.C2013135，保藏日期为2013年10月30日。【专利附图】【附图说明】图1:DHAV_C与5株单抗的Western blotting杂交结果:Μ:蛋白分子量标准；1: 5Η24-9 单抗;2: 3Ε18-4 单抗;3: 5Ε3-9 单抗;4: 5C20-9 单抗;5: 5Ν20-8 单抗；(代号没有特殊意义，只是筛选单抗过程中区分的标识)图2:基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体特异性的鉴定:A:DHAV-A与5株单抗的Western blotting 杂交结果；B:DPV 与 5 株单抗的 Western blotting 杂交结果；C:NDV与5株单抗的Western blotting杂交结果；D:AIV与5株单抗的Western blotting杂交结果；M:蛋白分子量标准;l:5C20-9单抗；2:3E18-4单抗；3:5E3_9单抗；4:5Η24_9单抗;5:5Ν20-8 单抗；【具体实施方式】实施例11.1抗原制备合成TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR, NLFESKLTPY, TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI, SSFKQDVMDQ, MDQIQSPSTV, PVLEIQPffGV, GVARMRAYTA,每个多肽合成 500 μ g。在合成多肽过程中在多肽的C-端加上半胱氨酸残基`，用thermo的SMPH双性多肽耦联试剂将多肽片段和KLH载体蛋白通过半胱氨酸耦联，作为抗原。提供抗偶联过程:1、将 20mg SMPH 溶于 2mI DMF。2、将0.8ml KLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加I XPBS (pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。3、将溶解好的SMPH溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应lh。4、用ILl XPBS (PH7.4)溶液于4°C下透析6小时，除去游离的SMPH。5、将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mgKLH-SMPH溶液转移到5ml离心管中。6、将3.0mg合成的混合多肽用0.6mll XPBS (pH7.2)溶液溶解。7、用Ellman试剂检测多肽中的巯基:在96孔板中加入100 μ I Ellman试剂储备液，再加入10 μ I多肽溶液，用Nano分光光度计在λ =412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；0D值〈0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值〈0.05返回多肽合成步骤重新质控。Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。8、将多肽液滴加到KLH-SMPH管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。9、用Ellman试剂检测多肽中的巯基:在96孔板中加入100 μ IEllman试剂储备液，再加入10 μ I教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ =412nm下测定紫外吸收值。OD值〈0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80%以上；0D值>0.03则再补加SMPH活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。1.2动物免疫将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠。抗原(100微克)与弗氏完全佐剂I: I混合，腹腔注射；2周后加强免疫I次，抗原(100微克)与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）合成多肽TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA，每条多肽的C‑端加上半胱氨酸残基；（2）将上述多肽混合（优选以等重量混合）并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；（3）将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠：抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合；（4）杂交瘤细胞株的制备与筛选：按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养；以步骤（1）合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%，获得稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为保藏编号为CCTCC NO.C2013135的杂交瘤细胞株；（5）取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，‑80℃冻存得到单克隆抗体的粗品；（6）粗品经纯化得到单克隆抗体，所述单克隆抗体为分子量为50KD左右为重链蛋白与分子量为25KD左右轻链蛋白的组合，为IgG2亚类。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳华，汤承，王远微，张焕容，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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