本发明专利技术公开了一种分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。以纯化的甘蔗花叶病毒(SCMV)粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗SCMV云南株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株22A6，其保藏号为CGMCC No.12007。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa轻链。该单抗与36kDa的SCMV外壳蛋白有特异性免疫反应。利用22A6单抗为核心建立检测玉米中SCMV的ACP-ELISA和dot-ELISA方法，这两种方法检测检测病叶的灵敏度分别达到1:163840和1:5120倍稀释(w/v,g/mL)。该杂交瘤细胞株22A6及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的诊断和检测、抗病育种及科学防控提供物质和技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗甘蔗花叶病毒单克隆抗体杂交瘤 细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
甘鹿花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起玉米矮花叶病和甘鹿花叶 病的病原。玉米矮花叶病于1963年首先在美国俄亥俄州大发生，随后美国多达37个州均相 继报道了该病毒病。1968年玉米矮花叶病在我国河南新乡和安阳爆发，给当地造成了巨大 的损失，仅辉县的粮食损失就达当年全县粮食总产量的33.53%，随后我国的其他地区也相 继发现了该病，如黑龙江、辽宁、北京、上海、浙江、广西和台湾等省（市区），其中以华北和西 北危害较为严重。而甘蔗花叶病是一种严重危害甘蔗生长的世界性甘蔗病毒病害，最早于 1892年在印度尼西亚的爪哇发现，随后在阿根廷、波多黎各、美国、古巴、中国等国家严重流 行，现已在全世界蔗区普遍发生，成为危害甘蔗生产最严重的病毒性病害之一，严重影响甘 蔗的产量和品质。 SCMV是马铃薯Y病毒属的重要成员之一，病毒粒子呈线状，无包膜，长750nm，宽 13nm，其基因组由一长约9.6kb的单链正义RNA组成。RNA基因组只有单一的大开放阅读框 (0RF)，编码一个约350kDa的多聚蛋白前体，在病毒编码的三种蛋白水解酶(Pl、HC-Pro和 NIa-Pro)的作用下被水解成至少10个成熟的功能蛋白，从N端到C端依次为PI、HC-Pro、P3、 61(1、(：1、61(2、￥?8、见 &-?仰川113和0?。近年又发现了第11个可能存在的蛋白？1?0。病毒粒子 的致死温度为55-60°C，稀释限点为10 3_105倍，室温下可体外存活1-2天。SCMV可以经病株汁 液摩擦、蚜虫、真菌等传播，也可经病株种子和玉米花粉传播。SCMV寄主范围仅限于禾本科 植物，但所涉及的范围较广。Rosenkranz等对SCMV的寄主范围做了系统研究，共测定了 39属 293种禾本科植物对SCMV的侵染性，结果发现SCMV能侵染200种以上的禾本科植物。我国的 史春霖等对北京地区的SCMV作了寄主范围测定，在供试的21种禾本科植物中，发现能被 SCMV侵染的有画眉草、野雀麦、虎尾草、蟋蟀草、小米、黍、稗、马唐、青狗尾草、高粱、大油芒、 矛叶荩草、玉米等13种，不能侵染大麦、小麦、黑麦、金丝雀麦草、约翰逊草、燕麦、草原看麦 娘、水稻。玉米在整个生育期均可感染甘蔗花叶病毒，幼苗期发病时先在心叶基部出现点条 状褪绿斑点，随后沿叶脉扩展至全叶，最终形成全株叶片花叶症状，随着病情的发展，叶片 将形成明显的黄绿相间条纹症状，最终全叶失绿;拔节期发病时，先在心叶基部出现褪绿斑 点，随后扩展至全叶成为典型的花叶症状;植株发育后期感病株叶片提早变黄，能抽穗结 籽，但籽粒少;重病株则多数表现早枯，几乎颗粒不收。甘蔗感病后，叶片呈现大小不一、黄 绿相间的嵌纹或条斑，种苗萌芽率下降，分蘖减少，生长缓慢，节间变短，品质变劣，蔗糖结 晶率下降。 本专利技术主要针对甘蔗花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用展开工作。当前甘 蔗花叶病毒的预警和监测体系尚未建立，甚至很多主要流行区并未进行病毒的预测预警和 防控工作。另外，目前仅用田间症状观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法来检测该病毒，但这 些检测方法效率低，并不适合大批量样品检测和田间应用。而血清学方法操作简单、特异性 好，且可规模化检测应用，但该方法必须依赖于特异和灵敏的病毒抗体。因此，本专利技术专利 利用杂交瘤技术制备了 1株能分泌抗SCMV单抗的杂交瘤细胞22A6,并用其分泌的单抗建立 了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国甘蔗花叶病毒的早期预测预警、准 确检测、抗病育种、科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗甘蔗花叶病毒单克隆抗体 杂交瘤细胞株及其单抗的应用。 分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12007,它能分泌抗甘 鹿花叶病毒Z5：南株系单抗。 一种所述的杂交瘤细胞株22A6所分泌的抗甘蔗花叶病毒云南株系的单抗，抗甘蔗 花叶病毒云南株系单抗腹水间接ELISA效价达10- 7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa轻链，该 单抗与36kDa甘蔗花叶病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该 单抗检测感染SCMV病叶的灵敏度达到1:163840倍稀释(w/v，g/mL)。 抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗与甘蔗花叶病毒云南株系和北京株系均有特异性 免疫反应，而与玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病 毒和健康玉米均不发生免疫反应。 抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各 种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株22A6分泌抗甘蔗 花叶病毒特异性单抗，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这 些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测甘蔗花叶病毒;2)利用本专利技术所制备的 单克隆抗体检测甘蔗花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备;3)利用本专利技术所 制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的甘蔗花叶病毒的检测。【附图说明】图1是dot-ELISA方法检测SCMV云南株系和北京株系的灵敏度分析； 图2是dot-ELISA方法检测SCMV的特异性分析； 1:感染SCMV云南株系的玉米叶片；2:感染SCMV北京株系的玉米叶片；3:感染玉米 褪绿斑驳病毒的玉米叶片;4:感染南方水稻黑条矮缩病毒的玉米叶片;5:感染水稻黑条矮 缩病毒的玉米叶片;6:感染马铃薯Y病毒的烟草叶片;7:健康玉米叶片;8:健康甘蔗叶片;上 下两个点为同一样品的重复。图3是dot-ELISA方法检测田间样品中SCMV的代表性结果；图4是RT-PCR方法检测田间样品中SCMV的代表性结果。23跑道为感染SCMV的玉米 病叶，作阳性对照，跑道24为健康玉米叶片，作阴性对照 生物保藏 杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.12007。【具体实施方式】 分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12007,它能分泌抗甘 鹿花叶病毒Z5：南株系单抗。 一种所述的杂交瘤细胞株22A6所分泌的抗甘蔗花叶病毒云南株系的单抗，抗甘蔗 花叶病毒云南株系单抗腹水间接ELISA效价达10-7,抗体类型及亚类为IgGl、kappa轻链，该 单抗与36kDa甘蔗花叶病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该 单抗检测感染SCMV病叶的灵敏度达到1:163，840倍稀释(w/v，g/mL)。 抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗与甘蔗花叶病毒云南株系和北京株系均有特异性 免疫反应，而与玉米褪绿本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗的杂交瘤细胞株22A6，其特征在于能分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗，杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12007。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，陈浙，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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