本发明专利技术属于食品工业生物技术领域，涉及一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用。本发明专利技术以枯草杆菌载体pHB201骨架，先通过酶切方法改造pHB201酶切位点，获得pHB-hc载体，在此计基础上通过PCR的方法枯草杆菌168基因组中克隆获得组成型强启动子P43，组成型启动子PamyE，Sec途径的分子伴侣PrsA以及中性蛋白酶信号肽SnprB，构建获得了枯草杆菌分泌型表达载体pHBSR。将从鱼腥藻基因组DNA中扩增获得脂肪氧合酶基因，插入到自主构建的表达载体pHBSR后，电转化如枯草杆菌宿主WB800，实现了重组脂肪氧合酶的分泌表达，发酵液中最大酶活达到76U/ml。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品工业生物
，涉及一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体及其应用。
技术介绍
溴酸钾作为焙烤工业面包蛋糕粉的品质改良剂，在国外尤其是欧美成功应用有几十年的历史。作为一种慢速氧化剂，改善面团结构和流变性，增强筋力和弹性，使焙烤制品获得满意的结果。我国也较早地将溴酸钾作为面粉品质改良剂，列入GB2760使用卫生标准，限量0.03g/kg。但规定焙烤后不得有残留。早期认为溴酸钾在焙烤后会分解掉，但是八十年代日本和英国，经长期研究发现，溴酸钾在焙烤后有残留物，对动物有致癌毒性。之后，FA0/WH0联合食品添加剂专家委员会(JECFA)，于1994年撤消了溴酸钾在面粉中使用的 ADI值，欧共体也在食品添加剂及其编号名单中，取消了溴酸钾。我国卫生部决定自2005年 7月1日起，取消溴酸钾作为面粉处理剂在小麦粉中使用。目前，国内外最常用的面粉漂白剂是过氧化苯甲酰。其漂白机理是过氧化苯甲酰在空气和酶的作用下水解，放出初生态的氧，从而氧化面粉中的不饱和脂溶性色素，使其失去颜色。科研工作者研究发现，长期过量使用过氧化苯甲酰对人体是有害的。过氧化苯甲酰水解后产生的苯甲酸，进入人体后要在肝脏内进行分解。长期食用加重肝脏负担，严重时肝、肾会出现病理变化，生长和寿命都将受到影响；面粉中残留的未分解的过氧化苯甲酰， 在面食加热制作过程中能产生苯自由基，进而会形成苯、苯酚、联苯，这些产物都有毒性，对健康有不良的影响；自由基氧化会加速人体衰老，导致动脉粥样硬化，甚至诱发多种疾病。 我国的国家标准中规定面粉中过氧化苯甲酰的最大使用量为0. 06g/kg。因此采用新型酶制剂和其它安全、天然的成分，开发出以酶制剂为主体的新型高效的能替代溴酸钾、过氧化苯甲酰的面粉品质改良剂成为食品加工研究的重点方向之一。脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12)，简称脂氧酶，属氧化还原酶，可催化含顺-顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸等)及酯形成氢过氧化物，生成的不稳定氢过氧化物能氧化面筋蛋白质形成二硫键，使蛋白质分子聚合，从而达到增强面筋的作用。脂氧酶还可以通过偶合反应破坏类胡萝卜素的双键结构，使得面粉漂白。因此，脂氧酶兼具面粉强筋和增白的功效，可以减少或替代化学强筋剂溴酸钾及化学漂白剂过氧化苯甲酰的使用，降低其对人体健康的危害。但由于目前脂氧酶主要从动植物组织中分离提取获得，产量低、纯度不够是制约其大规模应用的主要原因。脂氧酶的分离提取、结构分析和酶学性质研究是目前国内外学者的主要研究方向。对于如何实现脂氧酶的高效生产和工业化应用，目前国内相关研究甚少。食品用酶属于大宗工业产品，下游一般采用低成本的分离提取手段，不能保证诸如大肠杆菌热源物质完全去除；如果采用复杂的纯化方法，则成本就成为应用的限制性因素。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌，分泌蛋白能力强，细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA将其列为GRAS(Generally Recognized As Safe)级别的微生物。枯草杆菌表达系统已被成功地用于多种蛋白的表达，大部分是具有工业应用价值的酶，尤其是蛋白酶和淀粉酶。虽然关于外源蛋白表达的研究枯草杆菌还远远落后于大肠杆菌，但是在表达和分泌活性蛋白方面则明显优于大肠杆菌，在食品基因工程研究中更具有大肠杆菌无法比拟的优越性。近年来关于枯草杆菌应用于食品基因工程的研究，越来越受到重视。随着分子生物学和基因工程的飞速发展，有理由相信枯草杆菌表达系统将更加完善，成为原核蛋白表达的最佳宿主之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体。本专利技术的另一目的是提供该高效分泌表达重组脂肪氧合酶的枯草杆菌表达载体的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种枯草杆菌分泌表达载体pHBSR的构建方法，依次包含如下步骤i.构建载体 pHB-hc 合成一对引物 Pl :SEQ ID NO. 2/P2 =SEQ ID NO. 3，退火使之可以配对形成双链，两端形成Clal、XhoI的粘性末端；将退火双链产物与PHB201先后经 Clal/HindHI酶切得到的5. 4kb大片段连接，得到载体pHB_hc ；ii构建载体PHP43:以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，P43-F:SEQ ID NO. 4/ P43-R =SEQ IDNO. 5为引物，PCR扩增获得P43启动子，P43启动子经 ιοΙ/ClaI双酶切后插入经同样双酶切的载体pHB-hc中，得到载体pHP43 ；iii.构建载体pHP43R 以枯草杆菌168基因组为模板，P3 =SEQ ID NO. 6/P4 =SEQ ID NO. 7，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌淀粉酶E启动子基因PamyE;以枯草杆菌168基因组为模板，P5:SEQ ID NO. 8/P6 =SEQ ID NO. 9为引物，PCR扩增获得枯草杆菌分子伴侣 Sec分泌途径分子伴侣I^rsA ；以P3为上游引物，以P6为下游引物，以PCR反应产物PamyE 和基因片段混合物为模板，利用PCR的方法扩增获得启动子PamyE介导的表达的表达框PamyE-PrsA ；载体pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶处理，与经ClaI酶切的 PamyE-PrsA片段经T4连接酶连接获得载体pHP43R ；iv.构建分泌表达载体pHBSR 以 SnprB-F :SEQ ID NO. 10/SnprB-R :SEQ ID NO. 11 为引物，以枯草杆菌168基因组DNA为模板PCR扩增SnprB信号肽，通过EcoRI/BamHI双酶切反应获得SnprB信号肽基因，与同样双酶切处理的pHP43R载体通过T4DNA酶连接获得分泌表达载体pHBSR。按照上述的方法构建的枯草杆菌分泌表达载体pHBSR。一种分泌表达重组脂肪氧合酶的组成型重组表达载体pHBSR-ana-LOX，是将序列为SEQID NO. 1的脂肪氧合酶基因ana-LOX插入所述的分泌表达载体pHBSR的BioI酶切位点所得。所述的组成型重组表达载体pHBSR-ana-LOX的构建方法，包含如下步骤I.以鱼腥藻PCC7120基因组DNA为模板，克隆鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列为SEQ ID N0. 1，将其连接入pMD19-T克隆载体，测序正确后命名为 pMD19-ana-L0X ；II.按照上述方法构建枯草杆菌分泌表达载体pHBSR ；III.将质粒pMD19-ana_L0X与表达载体pHBSR分别进行BioI酶切处理，将回收得到的1368bp的ana-LOX基因片段与pHBSR线性大片段连接得到组成型重组表达载体 pHBSR-ana-LOX。所述的组成型重组表达载体pHBSR-ana-LOX在生产重组脂肪氧合酶中的应用。一种利用枯草芽孢杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，是将pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体电转化枯草杆菌宿主WB800得到含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因 ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌；将该基因工程菌接种于含氯霉素 /红霉素的LB培养基，37°C、ISOrpm本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，张充，吕凤霞，别小妹，王昱沣，赵海珍，应琦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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