【技术实现步骤摘要】
(一）
本专利技术涉及一种单克隆抗体片段的制备方法，特别涉及一种人绒毛膜促性腺激素 单克隆抗体片段的制备方法。 (二）
技术介绍
人绒毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotrophin, HCG)是人类受孕后分 泌的一种维持正常妊娠所需的糖蛋白激素，检测尿中的HCG即可证实妊娠。此外，研究发现 HCG的合成与分泌还与妇科疾病及恶性肿瘤等疾病相关，因此，HCG单克隆抗体不仅可用于 早期妊娠诊断，同时对妊娠相关疾病以及恶性肿瘤等疾病的诊断、鉴定具有一定的参考价 值。但是，完整的HCG单克隆抗体分子量大且结构复杂，在组织中穿透力差，且Fc片段的存 在在疾病治疗中易引起异种间免疫原性以及在早孕检测中易产生假阳性，从而使抗体在诊 断和治疗方面存在局限，而将HCG单克隆抗体片段化后产生的Fab或F (ab) ' 2片段与完整 的抗体相比具有：分子量小，穿透性强；与HCG结合的特异性增加；免疫原性降低等优点，从 而使抗HCG单克隆抗体的应用更安全、有效。因此，若能研制出纯度高、稳定性好的活性HCG 抗体片段并应用于妊娠及相关疾病诊断试剂的开发，必将带来可观的社会与经济效益。 根据目前国内外文献及专利报道，酶解抗体是获得抗体片段的主要方法，常用的 酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶等，其中以木瓜蛋白酶、胃蛋 白酶应用最为广泛，而游离酶水解抗体使酶无法重复利用，同时增加了消化液中抗体片段 的分离纯化难度，不利于高纯度抗体片段的获得，将酶固定化不仅增加了酶的稳定性，更降 低了后续抗体片段分离纯化...
【技术保护点】
一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所述方法为：将固定化木瓜蛋白酶溶于pH7.0，0.05mol/L PBS缓冲液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，20～40℃水浴反应2～10h，反应液离心，沉淀为固定化木瓜蛋白酶，回收利用；上清液为含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液；采用蛋白L亲和层析对含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液进行分离纯化，获得人绒毛膜促性腺激素抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶加入量以抗体体积计为0.1～1.0mg/ml，所述固定化木瓜蛋白酶载酶量为0.03～0.3g/g载体；所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体利用蛋白A亲和层析法从小鼠腹水中纯化获得；所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS‑PNIPAM为载体，以木瓜蛋白酶为底物，以pH 8.5，0.1mol/L的硼酸缓冲液和N,N‑二甲基甲酰胺为反应介质，在10～25℃水浴振荡2～10h，离心，取沉淀即为固定化木瓜蛋白酶；所述NHS‑PNIPAM为N‑羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚(N‑异丙基丙烯酰胺)；所述NHS‑PNIPAM与木瓜蛋白酶的质量比为1:0.1～1。
【技术特征摘要】
1. 一种人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所述方法为：将 固定化木瓜蛋白酶溶于PH7. 0,0. 05mol/L PBS缓冲液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入人 绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，20?40°C水浴反应2?10h，反应液离心，沉淀为固定化木 瓜蛋白酶，回收利用；上清液为含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液；采用蛋白L亲和 层析对含人绒毛膜促性腺激素抗体片段的水解液进行分离纯化，获得人绒毛膜促性腺激素 抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶加入量以抗体体积计为〇. 1?I. 〇mg/ml，所述固定化木 瓜蛋白酶载酶量为〇. 03?0. 3g/g载体；所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体利用蛋白A 亲和层析法从小鼠腹水中纯化获得； 所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS-PNIPAM为载体，以木瓜蛋白酶为底物，以pH 8.5， 0. lmol/L的硼酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺为反应介质，在10?25°C水浴振荡2?10h， 离心，取沉淀即为固定化木瓜蛋白酶；所述NHS-PNIPAM为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚 (N-异丙基丙烯酰胺）；所述NHS-PNIPAM与木瓜蛋白酶的质量比为1:0. 1?1。2. 如权利要求1所述人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体片段的分离方法，其特征在于所 述固定化木瓜蛋白酶溶液是将固定化木瓜蛋白酶溶于含终浓度5?20mmol/L半胱氨酸和 终浓度 I. 〇 ?2. Ommol/L EDTA 的 pH7. 0、0? 05mol/LPBS 缓冲液，制成 0? 1 ?3. Omg/ml 的固...
【专利技术属性】
技术研发人员：易喻，应国清，高虹，王鸿，梅建凤，陈建澍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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