高糖基化人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种高糖基化的重组人凝血因子VIII(FVIII)融合蛋白、其制备方法及用途。该融合蛋白从N端到C端依次包含人FVIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(优选人IgG Fc变体)。该融合蛋白具有与重组FVIII类似的生物学活性及延长的体内活性半衰期，从而改善药代动力学和药效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及融合蛋白领域，更具体地，涉及一种人凝血因子VIII(FVIII)的融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
技术介绍
凝血因子VIII(FVIII)，又称抗血友病因子，在内源性凝血体系中具有十分重要的作用。据FVIII分子遗传学的大量研究结果，表明性染色体X-连锁基因中缺乏FVIII时会导致A型血友病。据统计，血友病A在男性人群中患病率为1/5000，占血友病总数的80％以上。血友病A目前常用的治疗方法为替代治疗，即补充血友病患者所缺乏的凝血因子VIII。FVIII是多结构的大分子糖蛋白，分为6个结构域：三个A结构域(A1、A2、A3)，一个富碳水化合物且非必需的中央结构域(B-结构域)和两个C结构域(C1、C2)。成熟的蛋白质由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成。轻链分子量约为80kDa，结构包括A3，C1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至200kDa，结构包括A1，A2和B，连接方式为A1-A2-B。重链和轻链连接是金属离子依赖性的。在血浆中，重链和轻链的二聚体再以高亲和力结合冯.维勒布兰德因子(vonWillebrand,vWF)，保护其免于成熟前降解。血浆中非活化FVIII结合vWF的半衰期约为12小时。FVIII在重链内的氨基酸Arg372和Arg740，及在轻链内的Arg1689处被活化的凝血因子FX(FXa)及凝血酶蛋白水解切割而活化，导致vWF因子释放并产生活化的FVIII二聚体(FVIIIa)，在Ca2+存在下，它在磷脂表面上与活化凝血因子FIX(FIXa)及FX形成紧密复合物，FX接着被FIXa激活，活化的FX被从复合物中解离出来，转而将凝血酶原转化为凝血酶，后者能将纤维蛋白原直接转化成纤维蛋白。作为一种凝血系统的辅助因子，FVIII能使FIXa对FX的活化催化效率增强达几个数量级。FVIII分子是迄今克隆的最长的基因片段之一，且是应用于临床的分子量最大的蛋白药物。对于分子量大、糖基化程度高的重组蛋白，哺乳动物细胞是最优的表达系统。然而，FVIII在体外重组表达量明显低于与其它性质类似的基因，如FVIII表达水平只有FIX的1％。这可能是机体对FVIII需求的反映，但这对体外重组表达FVIII而言无疑是一大障碍。此外，由于FVIII在血液中半衰期较短，仅为8-12小时，严重血友病A患者进行预防性治疗，必须每周静脉内(i.v.)注射约3次。为了延长FVIII的体内功能半衰期，现有技术将FVIII与PEG、人血清白蛋白(HSA)、转铁蛋白或IgGFc等延长半衰期部分连接。例如，目前NovoNordisk(N8-GP)，Bayer(BAY94-9027)和Baxter(BAX855)公司均开发了PEG化的长效FVIII产品，并已进入临床研究，但在该蛋白制备工艺中增加了PEG与FVIII化学缀合的额外步骤，降低了最终产率、加大了制备成本。药代动力学研究数据显示，PEG化的FVIII并未获得显著延长的半衰期，如N8-GP在A型血友病患者体内的循环半衰期约18小时(TiedeA等，JThrombHaemost，2013，11:670-678)。BAY94-9027的临床I期研究显示其在健康人体内半衰期约为18.2小时，较野生型FVIII延长了约1.4倍(CoyleT等，Haemophilia，2012，18(Suppl3):22)。Bax855的半衰期约18小时(TurecekPL等，Hamostaseologie，2012，32Suppl1:S29-38)。由美国BiogenIdec公司开发的单体-二聚体杂合体型重组FVIIIFc融合蛋白(monomer-dimerhybridFVIII-Fc)：于2014年6月被美国FDA批准上市。临床数据显示，在人体内半衰期延长了仅1.5～1.7倍(DumontJA等,Blood,2012,119:3024–3030；PowellJS等,Blood,2012,119:3031–3037)，需每3～5天注射1次。据报道，Biogen公司构建的rFVIIIFc与Fc的双表达载体转染HEK-293细胞，在其表达的产物中并未预期检测出rFVIIIFc同源二聚体形式的融合体，仅表达出单体-二聚体杂合体型rFVIIIFc融合蛋白和Fc二聚体，该公司研究人员推测可能原因是所采用的表达系统因同源二聚体型分子量过大，宿主细胞未能成功分泌分子量约400KDa的rFVIIIFc同源二聚体蛋白，或因rFVIIIFc单体间的空间位阻效应，而未能发生聚合(PetersRT等,JThrombHaemost,2013,11(1):132-41)，由此可见，同源二聚体型FVIII融合蛋白的表达是相当困难的。人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也具有延长某些蛋白质体内半衰期的作用，因此一些专利文献公开的融合蛋白中包含的延长半衰期部分可以选择使用免疫球蛋白Fc片段、HSA、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。另外，CTP也可以作为接头，主要用于连接同一个蛋白质的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素的beta亚基和alpha亚基。本专利技术人没有根据现有技术将CTP作为接头或者作为延长半衰期部分，而是将它与柔性肽接头(例如(GGGGS)n)连接组成新的接头序列，设置于FVIII和延长半衰期部分之间(如，免疫球蛋白Fc片段，但不包括现有技术所提示的CTP)之间，组成新的FVIII融合蛋白，从而进一步延长了半衰期，并且保持了良好的生物学活性和功能。
技术实现思路
本专利技术提供一种高糖基化的同源二聚体型凝血因子VIII的Fc融合蛋白，具有延长的体内活性半衰期且与重组FVIII相似的生物学活性。此外，本专利技术提供了一种高效、稳定表达所述融合蛋白的方法，该方法表达的融合蛋白具有产量高、在制备和存储过程中稳定性好，并且其生物活性和已上市的重组FVIII因子相似的优点。本专利技术第一方面，提供一种高糖基化FVIII融合蛋白(以下简称融合蛋白)，所述融合蛋白从N端至C端依次含有人凝血因子VIII(hFVIII)、柔性肽接头(Linker，L)、至少一个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下简称CTP刚性单元，表示为(CTP)n，较优地，n为1,2,3,4,或5)和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgGFc变体(表示为vFc))。本专利技术的一些优选实施例中，所述融合蛋白表示为hFVIII-L-CTPn-vFc。其中，所述hFVIII为野生型或其突变型；进一步地，所述野生型hFVIII具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；优选地，所述突变型hFVIII与SEQIDNO：1所示氨基酸序列至少85％同源；更优选地，所述突变型hFVIII与SEQIDNO：1所示氨基酸序列至少90％同源。最优选地，所述突变型hFVIII与SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人凝血因子VIII的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含人凝血因子VIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体)。

【技术特征摘要】
1.一种人凝血因子VIII的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含人凝血因子VIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgGFc变体)。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的，优选是通过在哺乳动物细胞(如，中国仓鼠卵巢细胞)中表达而糖基化的。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人凝血因子VIII包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，或者所述人凝血因子VIII的氨基酸序列与如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列有至少90％的同一性。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头含有2个或多个选自G、S、A和T残基的氨基酸，优选地，所述柔性肽接头具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1，更优选地，所述柔性肽接头优选自下组：(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含如SEQIDNO：7所示氨基酸序列或其截短的序列，其中，所述截短的序列包含至少2个糖基化位点，优选地，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列：(i)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；(ii)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；(iii)SSSSKAPPPS；(iv)SRLPGPSDTPILPQ。6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元与权利要求5所述融合蛋白中的CTP氨基酸序列至少具有70％，80％，90％或95％的同一性。7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，朱文臣，李媛丽，朱成功，高永娟，任子甲，朱鹿燕，孙乃超，王晓山，刘宾，李智，王文文，姜明，王齐磊，王莉蕊，王淑亚，朱松林，高洁，苏鸿声，
申请(专利权)人：安源医药科技上海有限公司，辅仁药业集团有限公司，旭华上海生物研发中心有限公司，开封制药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31