治疗因子VIII抗体制造技术

本发明专利技术涉及治疗性FVIII抗体。特别地，本发明专利技术涉及具有延长FVIII的循环半衰期的能力的FVIII抗体。本发明专利技术还涉及此类抗体在A型血友病治疗和预防中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及A型血友病的治疗。特别地，本专利技术涉及治疗因子VIII抗体以及因子VIII抗体用于治疗A型血友病的用途。
技术介绍
A型血友病是由凝固因子VIII (FVIII)活性的缺陷或功能障碍引起的遗传出血障碍。临床表现不是在初级止血上-正常地发生血块的形成-而是凝块由于次级凝血酶形成的缺失而不稳定。A型血友病目前通过凝固因子FVIII的静脉内注射治疗，所述凝固因子FVIII从血液中分离或重组产生。治疗可以是在需要时或预防性的。近期公开的数据支持预防具有超过在需要时治疗的显著优点。这些包括出血频率的减少和发展血友病性关节病的更低危险，两者都导致对于患者更佳的生活质量。然而，虽然预防致使患者的基本上无症状生活成为可能，但它要求在外周静脉中的频繁注射，一般为一周三次，其已知是疼痛、困难和耗时的。此外，重复静脉穿刺在幼儿中不一定是可能的。因此，支持较不频繁的施用和/或经由更方便和安全途径的施用例如皮下施用的产品将更大程度的致使常规预防治疗成为可能。具有增强wt FVIII活化的能力的FVIII抗体公开于US20090297503中。然而，这种抗体也显示损害wt FVIII与vWF的结合。FVII1: vWF结合的损害一般被认为是不希望有的，因为因子VIII的循环半衰期在vWF结合后高许多倍。因此本领域需要支持不频繁施用和/或能够增强内源FVIII的活性，并且因此增强在患有A型血友病的患者中的促凝血应答的疗法。具有内源FVIII的患者包括患有轻度至中度形式的A型血友病患者和一部分的重症患者。专利技术概述 本专利技术涉及具有与活化人因子VIII结合的能力的单克隆因子VIII抗体，其中在与活化的因子VIII结合后，所述抗体减少或抑制A2结构域的解离，并且其中所述抗体不干扰vWF结合。本专利技术还涉及此类分子的治疗用途。此类抗体可以用于延长FVIIIa/FIXa复合物的寿命，导致更多凝血酶生成且因而改善凝块形成。此类抗体因此适合于治疗患有A型血友病并且未完全缺乏内源FVIII的患者，例如具有轻度和中度A型血友病的患者和具有重度A型血友病的患者亚群。任选地，此类抗体可以与因子VIII替代疗法组合使用。附图说明图1显示了来自功能产色初级筛选测定的结果。不具有解离时间(Max)的一个培养基对照和具有7.5分钟解离时间(Min)的培养基对照限定测定窗口。通过在测定中低于Min的活性证明的，几个样品抑制FVIII活性。有趣的是，显著部分的样品能够稳定FVIII至比不具有解离时间(Max)的对照更大的程度。图2显示了使用连同FVIII (磷脂依赖性)一起加入的磷脂或使用连同FIXa/FX混合物(磷脂不依赖性)一起加入的磷脂，在四个不同解离时间点(0-25分钟)以五个不同浓度(0-50 nM)测试的抗体。测量的信号(在405 nm处的吸光度)与在解离后的剩余FVIIIa活性成比例。比较两种反应条件，证实大多数抗体在磷脂的存在下能够稳定FVIIIa，而在FVIIIa衰变过程中在不存在磷脂的情况下的FVIIIa稳定程度更低。对于大多数抗体，即使在最低抗体浓度下也观察到FVIIIa的最大稳定。一个例外是在最低抗体浓度下具有更低稳定的4F136，指示相对低的亲和相互作用。图3。4F143对活化FVIII或FVIII S289L的时间依赖性自发衰变的作用。0.3 nM的FVIII用40 nM凝血酶在室温和pH 7.4下快速活化30秒，随后加入蛭素以灭活凝血酶。在所示时间点，将衰变混合物稀释到FIXa/磷脂内，并且测定在405 nm处的毫吸光度单位/分钟(mAU/分钟)的FX活化的起始速率。(A)在不存在磷脂的情况下，4F143的结合针对自发解离不稳定FVIIIa。在FVIIIa的活化和后续衰变过程中，在不存在磷脂的情况下以及在20 nM 4F143抗体的不存在(.)或存在下(▲)执行反应。(B)在磷脂的存在下FVIIIa通过4F143的显著稳定。稳定不依赖于在凝血酶活化前FVIII和抗体的预结合。在FVIII活化和衰变过程中，在10 μΜ磷脂的存在下执行反应。符号指示(.)不存在抗体，(▲)在FVIII活化和衰变过程中存在20 nM 4F143，和(▼)在FVIIIa衰变过程中存在20 nM 4F143。(C) 4F143能够减慢FVIIIa S289L的解离速率至在不存在抗体的情况下对于wt FVIIIa观察到的水平。在FVIII或FVIII S289L活化和衰变过程中，在10 μ M磷脂的存在下执行反应；(.，■)不存在抗体，( )在FVIIIS289L活化和衰变过程中存在20 nM 4F143。图4。在固相结合测定中抗体对FVIII与固定的vWF结合的作用。(A)在不存在抗体的情况下，用0.05 - 6.4 nM FVIII滴定vWF。根据单位点结合模型的数据分析给出0.29 土 0.01 nM的表观解离常数Gfd)，其与公开的值良好一致(Vlot等人，1995)。结果显示为平均值土标准差(η = 4)。(B)抗体对FVIII与vWF结合的作用在单一 FVIII浓度(0.8 nM)时进行研究,给出在不存在抗体的情况下与vWF的一半最大结合。抗体浓度范围为O - 162 nM ，其中最高浓度超过对于FVIII抗体相互作用测量的&的一个数量级(参见表2)。使用识别非重叠表位的抗FVIII抗体检测结合的FVIII。发现测试的抗体无一影响FVIII与vWF的相互作用。结果显示为平均值土标准差(η = 2)。图5。抗体对通过凝血酶的FVIII活化的作用。在37°C用I nM凝血酶且不存在或存在 100 nM ESH5 (.，点虚线)、100 nM ESH5 ( ),ESH8 (〇)、moAb216 (0)、4F143 (▲)、4F50 (▼)或4F140 (■)下，活化IOOnM FVII10在所示时间点，通过加入过量蛭素粹灭FVIII的进一步活化，并且通过rpHPLC定量FVIII活化程度为游离Al亚单位的量。发现ESH5、ESH8和moAb216都加速FVIII的活化，而对于4F143、4F50和4F140未观察到增加的活化速率。图6。通过质谱法监控的HX鉴定涉及4F143和4F41结合的FVIII区域。(A)对应于肽片段 aa 407-428 (SEQ ID NO 15)，YKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRF ([M+H] + = 549.5128，z = 5)的质量 / 电荷谱，(B)对应于肽片段 aa 591-602 (SEQ ID NO 16)，IQRFLPNPAGVQ([M+H]+ = 670.3730, z = 2)的质量/电荷谱，两者都鉴定为与FVIII结合的4F143表位的部分。(C)对应于肽片段 1965-1976 (SEQ ID NO 17), VRKKEEYKMALY (m/z = 524.9335, z=3)的质量/电荷谱，鉴定为与FVIII结合的4F41表位的部分。对于所有谱，上小图显示了非氘化对照，中和下小图分别显示了在mAb的不存在或存在下在与D20交换(in-exchange)30秒后的妝。图7。在4F143的存在下FVIII的代表性肽的氢交换时间曲线图。在4F143的不存在(■)或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.22 EP 10178292.8;2010.09.27 US 61/3867831.一种具有与活化的人因子VIII结合能力的单克隆因子VIII抗体，其中在与活化的因子VIII结合后，所述抗体减少A2结构域的解离，并且其中所述抗体不干扰VWF结合。2.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体不加速凝血酶活化。3.根据权利要求1或2中任一项的抗体，其中所述抗体与A2结构域结合。4.根据权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体与A3结构域结合。5.根据权利要求1-2中任一项的抗体，其中所述抗体与肽片段407-428(SEQ ID NO15)和/或591-602 (SEQ ID NO 16)等同或部分重叠的表位结合。6.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体与肽片段1965-1976(SEQ ID NO 17)等同或部分重叠的表位结合。7.根据权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体与4F143抗体的结合进行竞争。8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：H奥斯特加尔德，I希尔登，HL霍尔姆贝格，K兰贝尔特，JT克劳森，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：
国别省市：