本申请公开了神经诱向因子‑1上的线性或基本上线性表位，所述表位可能对应于神经诱向因子‑1特异性结合受体具体是UNC5类，特别是UNC5B和UNC5A的区域，或者可选地对应于神经诱向因子‑1特异性结合受体的区域的附近区域，当该表位结合抗体时阻止神经诱向因子‑1/受体相互作用。线性表位的这种确定允许申请人生产这样的抗体，所述抗体结合神经诱向因子‑1并干扰神经诱向因子‑1/受体相互作用，从而诱导表达或过表达神经诱向因子‑1和至少一种神经诱向因子‑1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡，这是由于这种相互作用抑制神经诱向因子‑1结合到受体和受体的多聚化的事实。本申请公开了针对该表位的鼠单克隆抗体和它们的各种人源化形式。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及可用于在神经诱向因子-1(netrin-1)(特别是肿瘤表达的神经诱向因子-1)的存在下诱导具有神经诱向因子-1受体(诸如UNC5受体)的肿瘤细胞的细胞死亡或细胞凋亡的神经诱向因子-1结合多肽或抗体，及其治疗癌症的用途。神经诱向因子-1是神经诱向因子家族的成员，并且在吸引和排斥的两者的背景下是轴突导向提示，并且在神经系统发育中起重要作用。神经诱向因子-1的主要受体是DCC(在结直肠癌中缺失)和UNC5(人中的UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D，小鼠中的UNC5H1、UNC5H2、UNC5H3、UNC5H4)，其都属于依赖性受体家族(Keino-Masu,1996,Cell 87:175-185；Ackermann,1997,Nature 386:838-842；Hong,1999,Cell 97:927-941；Mehlen,1998,Nature 395:801-804)。依赖性受体共有在不存在它们的各自配体的情况下诱导细胞凋亡的能力，由此这种能力在结合各自配体后被阻断(Mehlen,2004,Cell Mol Life Sci 61:1854-1866；Bredesen,2005,Cell Death Differ 12:1031-1043)。在各种人类癌症中，已经观察到DCC表达的减少或损失，和因此DCC诱导的细胞凋亡的减少或损失(Kinzler,1996,Proc Natl Acad Sci 100:4173-4178)。此外，已经观察到，UNC5基因在大多数结直肠肿瘤中也被下调，这表明依赖性受体UNC5的损失代表对于肿瘤细胞的选择性优势(Bernet,2007,Gastroenterology 133:180-1848；Shin,2007,Gastroenterology 133:1849-1857)。然而，不仅依赖性受体DCC和UNC5的下调提高各种肿瘤细胞的存活，而且还已经观察到它们的配体神经诱向因子-1的自分泌表达。具体地，已经显示，大多数乳腺肿瘤(即转移性乳腺癌)表现出神经诱向因子-1的表达增加(Fitamant,2008,Proc Natl Acad Sci 105:4850-4855)。到现在为止，已经证实UNC5的胞外部分的这两个免疫球蛋白(Ig)子结构域负责结合神经诱向因子-1，但并不清楚这两个结构域对于充分的神经诱向因子-1结合是否是必需的(Geisbrecht,2003,J.Biol.Chem.278:32561-32568；Kruger,2004,J.Neur.24:10826-10834)。如先前已经证明的，神经诱向因子-1被DCC的胞外域或此胞外域的部分的中和(充当神经诱向因子-1诱饵蛋白)可以在表达依赖性受体DCC和/或UNC5的肿瘤细胞中诱导细胞凋亡(EP-A1-1 989 546)。此胞外域或此胞外域的部分能够减少乳腺癌细胞转移到肺(Fitamant等，2008)。此外，也已证明此胞外域或此胞外域的部分增加表达高水平的神经诱向因子-1的非小细胞肺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的细胞死亡百分比(Delloye-Bourgeois,2009,J Natl Cancer Inst 101:237-247；Delloye-Bourgeois,2009,JEM 206:833-847)。WO2012025618公开了具有改进的DCC诱饵的DCC-融合蛋白。EP 1 989 546(WO2007099133)公开了作为药物的针对神经诱向因子-1或神经诱向因子-1受体的单克隆抗体或多克隆抗体，特别是针对神经诱向因子-1受体的胞外结构域或针对能够与神经诱向因子-1受体的胞外结构域相互作用的神经诱向因子-1的片段。本申请人现已确定了神经诱向因子-1上的线性或基本上线性表位，所述表位可能对应于神经诱向因子-1特异性结合受体(具体是UNC5类，特别是UNC5B和UNC5A)的区域，或者备选地对应于神经诱向因子-1特异性结合受体的区域的附近区域，当该表位结合抗体时阻止神经诱向因子-1/受体相互作用。线性表位的这种确定允许申请人生产这样的抗体，所述抗体结合神经诱向因子-1并干扰神经诱向因子-1/受体相互作用，从而诱导表达或过表达神经诱向因子-1和至少一种神经诱向因子-1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡，这是由于这种相互作用抑制神经诱向因子-1结合到受体和受体的多聚化的事实。本申请人也生产针对该表位的鼠单克隆抗体和它们的各种人源化形式。神经诱向因子-1的全长氨基酸序列作为SEQ ID NO：1给出并且编码其的cDNA以SEQ ID NO：2给出。在神经诱向因子-1的第二EGF样结构域中的线性表位已经被表征并描绘于SEQ ID NO：3、更特别是SEQ ID NO：35。编码这种表位的cDNA分别描绘于SEQ ID NO：4和36。本专利技术的第一个目的因此是代表神经诱向因子-1的线性表位或所述线性表位的片段或变体的多肽。更具体地，本专利技术涉及：-序列为SEQ ID NO：3的分离的或纯化的多肽，-与SEQ ID NO：3具有至少85、90、95、96、97、98或99％同一性的变体多肽，-至多200、150、100、90、80、70、60、50个氨基酸，并包括如上所述的SEQ ID NO：3或变体序列的变体多肽，诸如由SEQ ID NO：3的从位置9(A)到位置30(C)(包括这些氨基酸)的22个连续氨基酸组成的变体多肽，所述变体表示为SEQ ID NO：35，-包含SEQ ID NO：3的至少20、25或30个连续氨基酸的变体多肽诸如序列SEQ ID NO：35的变体多肽，或如上所述的变体序列，-序列为SEQ ID NO：35的多肽，或如上述变体序列，-由序列为SEQ ID NO：4或36的cDNA编码的分离的或纯化的多肽。本专利技术的另一个目的是编码所述代表神经诱向因子-1的线性表位或所述线性表位的片段或变体的多肽的cDNA。更具体地，本专利技术涉及：-序列为SEQ ID NO:4的cDNA序列，-借助于遗传密码简并性，编码序列SEQ ID NO：3或其变体的多肽的变体cDNA，-编码如早先所定义的变体多肽的变体cDNA，尤其是编码变体多肽SEQ ID NO:35的cDNA，诸如SEQ ID NO:36的cDNA，-与SEQ ID NO：4或36具有至少85、90、95、96、97、98或99％同一性的变体cDNA。根据本专利技术，变体多肽能够产生仍然保留下列能力的抗体，所述能力是特异性结合至神经诱向因子-1上的线性表位，并抑制神经诱向因子-1与其受体(具体是UNC5或DCC，尤其是UNC5B和UNC5A)的相互作用，并诱导表达或过表达神经诱向因子-1和神经诱向因子-1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡。变体cDNA编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：35的多肽或变体多肽。本专利技术的另一个目的是SEQ ID NO：3或35的多肽或其变体产生单克隆抗体的用途，并且这样产生的单克隆抗体也是本专利技术的一个目的。本领域技术人员知道允许使用浆细胞和杂交瘤技术产生单克隆抗体的方法。本专利技术涵盖使用这些方法来产生特异性针对SEQ ID NO：3或35的多肽或其变体的抗体本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的或纯化的多肽：‑其序列为SEQ ID NO:3，或所述多肽是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的变体多肽，或‑其由序列为SEQ ID NO:4的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的变体cDNA编码。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.10 EP 14305034.21.分离的或纯化的多肽：-其序列为SEQ ID NO:3，或所述多肽是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的变体多肽，或-其由序列为SEQ ID NO:4的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的变体cDNA编码。2.权利要求1的抗体，其序列如SEQ ID NO:35所描绘，或是与SEQ ID NO:35具有至少85％同一性的变体多肽。3.权利要求1的多肽，其由序列为SEQ ID NO:36的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的变体cDNA编码。4.序列为SEQ ID NO:4或36的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与SEQ ID NO:4或36具有至少85％同一性的变体cDNA。5.根据权利要求1-3任一项的多肽用于制备单克隆抗体的用途。6.神经诱向因子-1结合抗体，其特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或35的多肽或与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的变体多肽，其中结合多肽具有结合神经诱向因子-1并诱导肿瘤细胞经由UNC5受体或DCC受体的细胞死亡或细胞凋亡的性质。7.神经诱向因子-1结合抗体，其包含序列为SEQ ID NO:5的CDR1-H，序列为SEQ ID NO:6的CDR2-H，序列为SEQ ID NO:7的CDR3-H，和序列为SEQ ID NO:8的CDR1-L，序列为YAS的CDR2-L，和序列为SEQ ID NO:9的CDR3-L，其中所述抗体具有结合神经诱向因子-1并诱导肿瘤细胞经由UNC5受体或DC...
【专利技术属性】
技术研发人员：JG·戴尔克罗斯，Y·迪安，
申请(专利权)人：奈特里斯药物公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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