本申请描述了特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。进一步描述了结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体。进一步描述了用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】对EGFRvI I I有特异性的抗体结合位点本专利技术设及特异性结合EGFRvII I的结合蛋白和特异性结合EGFRvH I和CD3的多特 异性结合蛋白。本专利技术进一步延伸到结合EGFRWII和CD3的多特异性串联双抗体（tandem diabody)。特别是，本专利技术设及用于募集T细胞W专口有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高 细胞毒性EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体(TandA b?)。 EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR祀向抗体均已成功用于临床。然而，由 于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体W及那些处于开发中的抗体均 具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突 变体(deletion variantHiKEGFRWII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。 EGFRvIII专口在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表 达提供了开发专口祀向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细 胞毒性抗体的机会。 在本专利技术的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvin结 合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势： 它们不促进或促进来自祀向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，运有 利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本专利技术，细胞在所有测试条件 下暴露于EGFRWII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRWII受体分子仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本专利技术的EGFRVIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势 (图9)。本专利技术的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。[000引可使用亲和力成熟技术(affinity maUiration technique)使运些高亲和力结合 蛋白的亲和力得到进一步大幅提高W获得对EGFRWII有特异性、Kd在l(K)pM范围或更低的 结合蛋白。令人惊讶的事实是，运些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然 EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的 269个氨基酸的框内（in-打ame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRWII中形成新表位(neo- epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel化xtaposition of amino acidsK氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。 亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率化OFF)降低的结合蛋白的选择 来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合 速率化ON)，而koFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗 体结构域显示Kd小于lOOpM。 运些独特的性质使运些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特 别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与（immune effector cell engaging)、肿瘤祀向抗体治疗，诸如，例如EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体 (TandAb"). 在本专利技术的进一步方面中，提供了多价EGFRWII结合抗体，其对EGFRWII具有两 个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvHI具有两个结合位点之外，还对 T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。 在一个实施例中，使用对EGFRWII具有两个结合位点并另外包含对CD3具有两个 结合位点的EGFRvII I/CD3串联双抗体，并测试了它们与重组EGFRvII I-或EGFR-Fc融合抗原 的结合。在非还原条件下（由于完整的二硫键，分子结构仍部分保留），或在还原条件下（蛋 白结构完全变性），EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通过SDS-PAGE分离，通过蛋白质印迹 (Western Blotting)转移至PVDF膜，并使用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体抗体(diabody ant化ody)或EGFR-结合IgG西妥昔单抗来评估结合W修饰(decorate)印迹（图4)。该实施例 显示，包含对EGFRvIII具有两个结合位点的亲代EGFRvIII结合结构域和亲和力成熟的 EGFRvH I结合结构域在多价抗体形式中也保持其对EGFRvH I的选择特异性。在还原和非还 原条件下，所有EGFRWII/CD3串联双抗体均能识别EGFRvIII，但在任意的运些条件下均不 能识别全长野生型EGFR。该实施例还证明，本文所描述的EGFRWII特异性结合结构域能识 别线性表位，且其反应性不需要完整的Ξ维结构。运与EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗(爱必 妥化rbitux))相反，EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗能识别野生型EGFR和成熟的EGFRvIII， 但其反应性显然需要完整二硫键与构象表位(图4)。 在另一个实施例中，使用包含与不同CD3结合结构域组合的亲代的或亲和力成熟 的EGFRvIII特异性结构域和/或在串联双抗体分子中具有不同顺序单个结合结构域的 EGFRvII I/CD3串联双抗体。具有结构域顺序Vl?3-VhEwkviiI-VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体在串 联双抗体分子的中部含有二价EGFRvIII结合位点，而具有结构域顺序VhEwkviiI-化?3-Vh?3- 化EGWviii的串联双抗体在外面的位置具有两个EGFRvIII结合位点且在中部具有两个CD3结 合位点。在ELISA中，分析串联双抗体的不同EGFRvIII-结构域和结构域顺序突变体与 EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的浓度依赖性结合W及与CD3抗原的浓度依赖性结合（图 6)。所有含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体均显示了与EGFRvIII结合的 大幅提高，清楚地表现为相应的结合曲线向较低浓度移位大于两个数量级（图6)。没有观察 到任何串联双抗体与野生型EGFR抗原的结合。 可通过隧菌体展示文库（phase display libraries)选择和鉴定抗EGFRWiUjt 体，例如选择性地结合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-结合蛋白。Τ细胞 是不能由天然抗体募集的有效的肿瘤杀伤效应细胞。因此，在本专利技术的进一步方面中，本发 明提供了一组多特异性EGFRVIII/CD3抗原-结合蛋白，特别是串联双抗体，其能募集Τ细胞、 具有宽范围的结合特性和细胞毒性特性。在一组体外试验中表征了本专利技术的抗原-结合蛋 白的结合特性、Τ细胞介导的细胞毒性活性和祀标介导的Τ细胞活化的特征。在FACS中，本发 明的抗原-结合蛋白对Biacore、ELISA和EGFRvIII-阳性细胞中的EGFRvIII抗原显示异常的 特异性。在测试的全浓度范围内，没有观察到任何结合蛋白与E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包含抗体可变重链结构域和/或抗体可变轻链结构域，所述抗体可变重链结构域包含选自SEQ ID NO：27、33、42、46、49、53的CDR1，选自SEQ ID NO：28、38、43、50、54、61、63的CDR2和SEQ ID NO：29的CDR3，所述抗体可变轻链结构域包含选自SEQ ID NO：30、34、36、39、44、47、51、56、59、64的CDR1，选自SEQ ID NO：31、40、57的CDR2和选自SEQ ID NO：32、35、37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的CDR3。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂娜·埃尔旺格，乌维·罗伊施，伊维卡·法斯克，斯特凡·奈克马斯，薇拉·莫尔肯斯恩，梅尔文·利特尔，尤金·朱可夫斯基，
申请(专利权)人：阿菲姆德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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