一种cDNA的特异性分子标签及其应用制造技术

一种cDNA的特异性分子标签及其应用，该特异性分子标签包括：如SEQ ID NO.1所示的通用引物序列；如SEQ ID NO.2所示的转座酶接头序列P7；随机序列：(N)

【技术实现步骤摘要】
一种cDNA的特异性分子标签及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种cDNA的特异性分子标签及其应用。
技术介绍
在过去的二三十年里，二代测序的大规模序列分析技术极大的推动了基因组和转录组的序列分析。转录组的测序因为不需要对整个转录组预先设计探针并且可以检测未知转录本，已经逐渐取代传统的基因表达谱芯片成为首选的转录组分析方案。转录组是指在某一特定阶段，由细胞转录出来的全部RNA，包括mRNA和非编码RNA。转录组学就是从RNA水平研究基因的表达情况，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律。与基因组不同，转录组学研究包含了时间和空间的限定，同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。传统的转录组分析需要数万至数十万个细胞，这种基于群体水平的方法将大量的基因表达取平均值进行分析，无法揭示细胞之间基因表达的异质性。另外，当目标细胞数目稀少又难以培养时，这种传统的分析方法就无能为力了，就需要用到单细胞转录组分析技术。单细胞转录组测序技术的分辨率精确到单个细胞，为辨别异质性群体中各种细胞类型的转录组特征提供了有力的工具。传统的建库方法使用超声波、雾化等方法片段化DNA，需要较大量的起始材料，然后通过末端修复、添加接头等步骤实现。然而基于单细胞的转录组测序起始总RNA量极少，这种方法不适合，这是让许多潜在用户感到失望的一点。构建cDNA文库是单细胞转录组分析的关键技术步骤，其方法包括分离单细胞、细胞裂解、mRNA逆转录成cDNA、cDNA片段化与加接头、文库扩增几个步骤。单细胞的转录组测序起始总RNA量极少，在不去除核糖体RNA的情况下使用多聚胸腺嘧啶(oligo-dT)作为逆转录引物获得大量的全长cDNA，利用逆转录酶的模板转换(template-switching)活性在cDNA的3｀端加上一段接头序列，这段接头序列可用于全长cDNA扩增进而得到整个mRNA的序列，从而避免3｀端的偏好性。使用转座酶的建库方法可以在打断的同时在片段化DNA两端加上接头，将繁琐的DNA片段化、末端修复和连接反应等步骤变为了一步简单的酶促反应，这种方法极大的减少了起始模板量和样品处理时间。转录组的研究可以从整体水平上来研究基因功能和基因结构，揭示生物过程的分子机理，量化各转录本在其中的表达水平变化，因此被广泛应用于生物学研究、药物研发、基础研究以及临床诊断等领域。然而，确定两个不同物种或单一样品中不同基因的绝对数量丰度很有挑战性，由于PCR扩增的偏好性，不同表达量的mRNA在经过后续建库的PCR扩增后反应出来的信息具有不准确性，后续的生物信息分析数据无法真实的反应基因表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种cDNA的特异性分子标签及其应用，该特异性分子标签加在每一个cDNA的5｀端，使每一个基因都是独一无二的，后续的信息分析可以根据该特异性分子标签的序列量化样品中每一个基因。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种cDNA的特异性分子标签，其全长序列中包含：通用引物序列；转座酶接头序列P7；随机序列：(N)n，N为随机序列，共n个；和poly(T)序列；其中，所述通用引物序列如SEQIDNO.1所示，转座酶接头序列如SEQIDNO.2所示，poly(T)序列共有30个T碱基即T30VN。优选的，本专利技术所述cDNA的特异性分子标签，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具体序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N为随机序列，共n个，N选自A、T、C、G；优选的，n为5-10。本专利技术所述cDNA的特异性分子标签在cDNA建库中的应用。所述cDNA的特异性分子标签还应用于利用转座酶打断的cDNA建库中。本专利技术还提供一种利用转座酶打断的cDNA建库方法，其包括如下步骤：1)分离单细胞，将单细胞裂解后释放总RNA；以mRNA为模板、权利要求1或2所述特异性分子标签为引物逆转录合成第一链cDNA，使所述特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，且在逆转录过程中，利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段接头序列，该接头序列与如SEQIDNO.1所示的通用引物序列相同；以第一链cDNA为模板，以如SEQIDNO.1所示的通用引物序列为引物通过PCR扩增合成带特异性分子标签的全长cDNA，并对PCR扩增产物进行纯化；2)将步骤1)所得全长cDNA与转座酶包埋复合物进行孵育，完成cDNA片段化和加接头，其中转座酶包埋复合物包括转座酶和退火接头；3)使用上游引物N7和下游引物N5对步骤2)得到的片段化产物进行PCR扩增；其中，上游引物N7的序列如SEQIDNO.4所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG，下游引物N5的序列如SEQIDNO.5所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC；4)对步骤3)所得PCR扩增产物进行纯化，获得带特异性分子标签的cDNA的5`端文库。进一步，步骤2)中，所述转座酶包埋复合物的制各方法包括：配制体系：配制体系：转座酶(10U)12-15μL、退火接头5μL、包埋缓冲液12-15μL，总体积33μL，用移液器轻轻吹打混匀，将配好的反应体系置于PCR仪上30℃反应1.5小时，-20℃保存。所述转座酶包埋复合物中的转座酶为Tn5家族转座酶，野生型Tn5转座酶、突变型Tn5转座酶均适用于本专利技术；所述退火接头的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA。再，步骤2)中，所述的cDNA片段化和加接头方法包括：配制反应混合液：所述转座酶包埋复合物3-7μl，转座酶反应缓冲液4-8μl；将5`端加上所述特异性分子标签的cDNA与反应混合液混合，用移液器吹打混匀；在PCR仪中55℃反应10-15min。本专利技术所述的特异性分子标签共有4n种，通过其上poly(T)序列的30个T碱基与mRNA上的poly(A)尾退火互补在逆转录酶的作用下进行逆转录获得第一链cDNA，特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段与通用引物序列相同的接头序列；通过如SEQIDNO.1所示的通用引物可扩增合成得到带特异性分子标签的全长cDNA，该全长cDNA无3`和5`偏好性。本专利技术所述的使用转座酶打断的建库方法，在cDNA片段化过程中，片段化断口的两端被加上转座酶的退火接头，即除cDNA的3`和5`端外，片段化的DNA的两端都有相同的退火接头序列P5(如SEQIDNO.6所示)；而cDNA的5`端特异性分子标签上带有转座酶接头序列P7，因此利用带有转座酶接头序列(如SEQIDNO.2所示)的N7引物和带有退火接头序列(如SEQIDNO.6所示)的N5引物就可以通过PCR反应富集cDNA的5`端。后续的生物信息分析可以通过标记在每一个cDNA的5`端上的特异性分子标签中的随机序列来区别文库中每一个cDNA的来源，实现cDNA的绝对定量。在全长cDNA制备过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种cDNA的特异性分子标签，其全长序列中包含：通用引物序列；转座酶接头序列P7；随机序列：(N)

【技术特征摘要】
1.一种cDNA的特异性分子标签，其全长序列中包含：通用引物序列；转座酶接头序列P7；随机序列：(N)n，N为随机序列，共n个；和poly(T)序列；其中，所述通用引物序列如SEQIDNO.1所示，所述转座酶接头序列P7如SEQIDNO.2所示，所述poly(T)序列共有30个T碱基即T30VN。2.根据权利要求1所述cDNA的特异性分子标签，其特征在于，所述特异性分子标签的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具体序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N为随机序列，共n个，n为5-10。3.如权利要求1或2所述cDNA的特异性分子标签在cDNA建库中的应用。4.如权利要求1或2所述cDNA的特异性分子标签在利用转座酶打断的cDNA建库中的应用。5.一种利用转座酶打断的cDNA建库方法，其特征在于，包括如下步骤：1)分离单细胞，将单细胞裂解后释放总RNA；以mRNA为模板、权利要求1或2所述特异性分子标签为引物逆转录合成第一链cDNA，所述特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端，且在逆转录过程中，利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段接头序列，该接...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，张力军，聂俊伟，齐心，韩锦雄，瞿志鹏，张晨曦，徐晓昱，叶廷跃，王丹凤，刘辉辉，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32