一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用，其中该标签接头包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。在受检样本中引入本发明专利技术的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，本发明专利技术的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测序
，具体地，涉及一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用。
技术介绍
现阶段的文库构建和测序中，将受检样本连接标签接头，可以区分来源不同的样本，但是对样本突变的检测灵敏度较低。因而，目前的标签接头仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够提高样本低频率突变检测灵敏度的标签接头。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现和工作而完成的：专利技术人在进行高通量测序的过程中发现了一种特殊的单分子标签设计和读取方法，受检样本通过连接随机单分子标签，可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，也即通过在样本中引入随机单分子标签能够有效提高检测灵敏度。并且，专利技术人还发现，为避免文库构建及测序过程中淹没掉低至0.1％的突变位点，在测序的结果中要把带有同样单分子标签的测序Reads只计数为1，通过统计不同的随机单分子标签的个数来还原原样本中的真实EGFR突变位点频率。具体地，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种标签接头。根据本专利技术的实施例，该标签接头包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。专利技术人惊奇地发现，在受检样本中引入本专利技术的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，本专利技术的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种构建待测样本测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法利用前面所述的标签接头作为测序文库的接头。由此，可以有效在受检样本中引入本专利技术的标签接头，进而后续利用该测序文库进行测序和分析时，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点。在本专利技术的第三方面，本专利技术还提供了一种对多个待测样本进行测序的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，其中，针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。由此，能够有效在多个受检样本中引入本专利技术的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本专利技术的标签接头制备简单，从而本专利技术的测序方法操作简单，实施容易。在本专利技术的第四方面，本专利技术还提供了一种对多个待测样本进行测序的系统。根据本专利技术的实施例，该系统包括：文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，并且适于针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。由此，能够有效在多个受检样本中引入本专利技术的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本专利技术的标签接头制备简单，从而本专利技术的测序系统操作简单，实施容易。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了实施例1的电泳检测结果；图2显示了实施例2的电泳检测结果；图3显示了根据本专利技术实施例的对多个待测样本进行测序的系统的结构示意图；图4显示了现有的不带随机单分子标签的illumina二代高通量测序文库的结构示意图；图5显示了现有的一种含有随机单分子标签的illumina二代高通量测序文库的结构示意图；以及图6显示了根据本专利技术实施例，本专利技术的测序文库(含有随机单分子标签)的结构示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种标签接头。根据本专利技术的实施例，该标签接头包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。专利技术人惊奇地发现，在受检样本中引入本专利技术的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，现有的单分子标签接头的制作方法比较繁琐，而本专利技术的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。其中，第二核酸序列也即随机单分子标签序列的长度不受限定，只要能够有效标记样本的各DNA片段，且不影响后续扩增、测序效果即可。根据本专利技术的一些优选示例，第二核酸序列为8bp的NNNNNNNN。其中，这里的“N”即表示ATCG四种碱基的任意一种。同理，第三核酸序列即样本标签序列的长度也不受限定，根据本专利技术的一些优选示例，第三核酸序列为7bp的IIIIIII。这里的“IIIIIII”表示长度为7bp分子标签。根据本专利技术的一些具体示例，本专利技术的标签接头序列为：第一链为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，第二链为：pGATCGGAAGAGC(也即第二链的5’端使用磷酸基团修饰)。由此，利用该标签接头连接的受检样本，突变检测灵敏度高，且检测结果准确可靠，可重复性好。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种构建待测样本测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法利用前面所述的标签接头作为测序文库的接头。由此，可以有效在受检样本中引入本专利技术的标签接头，进而后续利用该测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标签接头，其特征在于，包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。

【技术特征摘要】
1.一种标签接头，其特征在于，包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。2.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，第二核酸序列为8bp的NNNNNNNN。3.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，第三核酸序列为7bp的IIIIIII。4.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，第一链为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，第二链为：pGATCGGAAGAGC。5.一种构建待测样本测序文库的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的标签接头作为测序文库的接头。6.一种对多个待测样本进行测序的方法，其特征在于，包括：针对所述多个待测样本的每一个，分别根据权利要求5所述的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，宋卓，袁梦兮，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43