一种突变的COL4A5基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种突变的COL4A5基因及其应用。一种用于检测Alport综合征的突变的COL4A5基因，COL4A5基因的突变使编码的IV型胶原α5第1371位丝氨酸突变为终止子，导致截短的IV型胶原α5链。本发明专利技术所述的突变的COL4A5基因或者所述的突变的IV型胶原蛋白α5链在制备AS检测试剂或检测设备中的应用。所述的检测设备进一步优选包括含有检测突变的COL4A5基因的基因芯片的检测平台。本发明专利技术提供了AS新的致病基因的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础。

Mutant COL4A5 gene and uses thereof

The present invention discloses a mutant COL4A5 gene and its application. A COL4A5 gene for detecting mutations in the Alport syndrome, a mutation in the COL4A5 gene that encodes a type IV collagen alpha 5, a 1371st position serine mutant into a terminator, resulting in a truncated type IV collagen alpha 5 strand. The mutant COL4A5 gene or the mutant type IV collagen alpha 5 chain described in the invention is used in the preparation of a AS detection agent or a detection device. The detection device further selects a detection platform including a gene chip containing a COL4A5 gene for detecting mutations. The present invention provides the pathogenic loci of AS novel pathogenic genes and provides a new molecular biological basis for the diagnosis of the disease.

【技术实现步骤摘要】
一种突变的COL4A5基因及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种突变的COL4A5基因及其应用。
技术介绍
Alport综合征(alportsyndrome，AS)是一种以进行性肾功能减退和肾小球基底膜结构异常伴神经性耳聋和眼病为临床特征的遗传性肾病。目前认为AS有三种遗传方式：X连锁显性遗传(XL；约占80％)，常染色体隐性遗传(AR；约占15％)和常染色体显性遗传(AD；极少数)，分别由编码Ⅳ型胶原不同α链的基因COL4A5(或COL4A5和COL4A6)、COL4A3和(或)COL4A4突变所致。X连锁遗传致病基因有COL4A5(或COL4A5和COL4A6)，COL4A5定位于Xq22，是与AS联系最紧密的基因，自第一个COL4A5突变发现以来，已有400多种基因突变在欧洲、亚洲地区和美国相继报道，突变类型多种多样。COL4A6和COL4A5基因头对头相邻位于X染色体上，有学者认为单独的COL4A6基因突变不会导致AS的发生。目前还没有发现COL4A6基因单独的变异的情况，COL4A6基因突变均伴有COL4A5基因异常，出现AS伴弥漫性平滑肌瘤。常染色体遗传致病基因有COL4A3和(或)COL4A4。这些患者既可为该基因突变的复合杂合子或纯合子，又可为杂合子。文献报告的所检测得到的COL4A3基因突变均为点突变，且突变位置分布于整个基因、无明显的热点突变，突变类型多种多样。已报道的在AR的AS家系中发现的COL4A4基因突变也均为点突变，且突变位置分布于整个基因、无明显的热点突变，突变类型多种多样。由于AS具有高度的临床和遗传异质性，传统的Sanger基因检测方法需要消耗大量的时间与成本。因此，开发高效、快捷、经济、可同时对多个已知致病基因进行突变检测的方法对其临床诊断非常重要。明确受检人的致病基因和突变，实现对AS的准确诊断、个性化治疗以及产前诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对AS，提供一种突变的基因COL4A5。本专利技术的另一目的在于提供该基因在制备AS诊断试剂中的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种用于检测Alport综合征的突变的COL4A5基因，COL4A5基因的突变使编码的IV型胶原α5第1371位丝氨酸突变为终止子，导致截短的IV型胶原α5链。所述的突变的COL4A5基因，野生型COL4A5基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000188153，突变的COL4A5基因在物理位置107925013处碱基C缺失，导致移码框偏移，产生了提前的终止子，其他部分与野生型相同。一种突变的IV型胶原蛋白α5链，野生型IV型胶原蛋白α5链在Ensemble数据库中的基因转录本编号为：NM_033380.2，突变的IV型胶原蛋白α5链在该野生型蛋白的第1371位氨基酸由丝氨酸突变为终止子,其他部分与野生型相同。本专利技术所述的突变的COL4A5基因或者所述的突变的IV型胶原蛋白α5链在制备Alport综合征疾病检测试剂或检测设备中的应用。所述的检测试剂优选：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。所述的检测设备进一步优选包括含有检测突变的COL4A5基因的基因芯片的检测平台。一种检测Alport综合征的试剂盒，所述的试剂盒包括：(a)检测COL4A5基因物理位置为107925013核苷酸位点的试剂；或检测IV型胶原α5链第1371位氨基酸位点的试剂；(b)说明书。所述的试剂优选引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。所述的试剂进一步优选基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。其中，检测COL4A5基因物理位置为107925013处核苷酸位点的杂交探针序列可以自行设计,也可以直接委托商业机构设计合成。这些探针序列的设计为本领域的常规技术。一种以深度测序为平台筛查AS患者中COL4A5基因突变的方法，包括以下步骤：(1)建立AS患者家系临床与遗传资源库，收集AS家系的临床资料及血液标本，提取基因组DNA；(2)设计用于检测COL4A5基因突变的杂交探针，并将其整合到基因芯片上；(3)利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序；(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选到一个新的AS致病突变为COL4A5；NM_033380.2c.4112delC；p.Ser1371*。在基因水平上，该突变是位于X染色体上COL4A5基因的物理位置为107925013(Ensemble数据库)处的碱基C缺失；在RNA水平上，该突变导致COL4A5基因编码的RNA第4112位的碱基C缺失；在蛋白水平上，COL4A5基因编码蛋白第1371位氨基酸由丝氨酸突变为终止子。其中，步骤(2)所述的基因芯片优选Roche-NimbleGen公司生产的基因芯片。步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选利用美国Illumina公司的Hi-seq2000仪器完成。步骤(3)步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选利用美国Illumina公司的Hi-seq2000仪器完成。步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选流程为：将基因组DNA片段化，在DNA末端标记“A”并与IlluminaPE接头-寡核苷酸混合物相连接；连接产物经PCR富集，获得DNA文库，并将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列；创建配对末端，在IlluminaHiSeqTM2000平台上对目标序列进行测序。有益效果1.AS是常见的、严重的导致终末期肾病的疾病。挖掘AS的新致病突变和新致病基因有利于进一步探索AS的分子遗传学病因，是充分利用我国的肾脏病科的AS资源，造福AS患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本专利旨在探索AS的遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治疗。2.大量研究证实，IV型胶原基因的突变能够引起AS,本专利的候选基因涵盖了4个已知致病的基因(COL4A3，COL4A4和COL4A5和COL4A6)，这些基因均是由申请人在多年从事遗传学研究的基础上查阅大量文献所筛选出的，通过本专利技术方法的到进一步明确了这些基因不同类型的突变与AS的关系。3.AS具有显著的遗传异质性，目前已知致病基因3个，仍存在大量未知的致病突变，应用传统技术研究显然具有很大的局限性。本专利技术提供了AS新的致病基因的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础。附图说明图1挖掘致病基因新突变的技术路线图2深度测序流程图3家系图图4测序峰图具体实施方式实验方法：1.AS遗传资源库的建立。1.1收集以下三类AS患者的临床资料及血液标本：1.1.13代或超过3代的X染色体连锁显性遗传的AS家系。1.1.2收集X染色体连锁显性遗传的小家系。1.1.3收集无家族史的IV型胶原蛋白α5链染色阴性的散发病例。1.2提取基因组DNA：采用TIANamp血液DNA抽提试剂盒(TiangenBiotechCo.Ltd,Beijing,China)，按照厂家提供的protocol从采集到的病人外周血中提取病人的基因组DNA。2.挖掘AS已知致病基因COL4A5的新突变。2.1设计并定制AS相关基因捕获芯片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测Alport综合征的突变的COL4A5基因，其特征在于COL4A5基因的突变使编码的IV型胶原α5链第1371位丝氨酸突变为终止子，导致截短的IV型胶原α5链。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测Alport综合征的突变的COL4A5基因，其特征在于COL4A5基因的突变使编码的IV型胶原α5链第1371位丝氨酸突变为终止子，导致截短的IV型胶原α5链。2.根据权利要求1所述的突变的COL4A5基因，其特征在于野生型COL4A5基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000188153，突变的COL4A5基因在物理位置为107925013的碱基C缺失，其他部分与野生型相同。3.一种突变的IV型胶原蛋白α5链,其特征在于野生型IV型胶原蛋白α5链在Ensemble数据库中的基因转录本编号为：NM_033380.2，突变的IV型胶原蛋白α5链在该野生型蛋白的第1371位氨基酸由丝氨酸突变为终止子,其他部分与野生型相同。4.权利要求1所述的突变的COL4A5基因或者权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓军，刘建红，刘志红，崔英霞，魏秀秀，高二志，李昂，夏欣一，阿叁，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区南京总医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32