一种白介素－2突变基因及其制备制造技术

本发明专利技术涉及基因重组技术，具体地说是一种ＩＬ－２突变基因及其制备，它具有序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１中碱基序列，是以天然ＩＬ－２基因为基础，利用重叠ＰＣＲ，对其基因上的碱基有针对性地、重点突变，获得一ＩＬ－２新突变基因。主要特点是突变的位点少，但蛋白的表达率相当于国内外同类表达方法的表达水平。本突变基因没有改变天然蛋白的氨基酸序列，与天然蛋白一致。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因重组技术，具体地说是一种白介素-2(IL-2)突变基因及其制备。
技术介绍
IL-2是一种激活T-细胞产生在淋巴细胞间作用淋巴因子；人类IL-2是一条由133个氨基酸残基组成的多肽链(Rene Devos，GeertPlaetinck，Hilde Cheroutre，Guus Simons，Wim Degrave，JanTavernier，Erik Remaut and Waltr Fiers，Molecular cloning of humaninterleukin 2 cDNA and its expression in E.coli.，Nucleic AcidsResearch，1983，11(13)4307-4323)。最近几年IL-2用于肿瘤治疗的研究使人们重视了它的人工置备。用大肠杆菌来表达蛋白是很常用的一种方法，但大肠杆菌在表达真核基因时，存在稀有密码子的问题；这样将稀有密码子突变为大肠杆菌常用密码子成为一种方法，不同的位点突变其表达效果也不一样，如何通过较少的突变达到最佳表达效果成了一个焦点问题。D.P.Williams等人根据此原理合成七段核苷酸，然后将其连接，在大肠杆菌中表达(D.P.Williams，D.Rcgier，D.Akiyoshi，F.Cenbauffe andJ.Murphy.Desin，snthesis and expression of a human interleukin-2gene incorporating the codon usage bias found in highly expressedEscherichia coli gene. Nucleic Acids Research，1988，16(22)10453-10467)；此作为每段的碱基约70几个，合成费用也高；另外其突变的位点太多，重点不突出，且是化学合成的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过对IL-2基因上的碱基有针对性地、重点突变，使之在大肠杆菌中实现高效表达的突变点的突变基因及其制备。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下一种白介素-2突变基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；其制备方法以人的IL-2基因为模板，选取重点区域进行碱基突变，突变区域可以为下述碱基区域的任意组合；第一个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第3个碱基到第21个碱基所形成的区域；第二个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第30个碱基到第5 1个碱基所形成的区域；第三个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第73个碱基到90个碱基所形成的区域；第四个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第99个碱基到第126个碱基所形成的区域；第五个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第141个碱基到第153个碱基所形成的区域；第六个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第207个碱基到第222个碱基所形成的区域；第七个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第238个碱基到第249个碱基所形成的区域；第八个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第288个碱基到第315个碱基所形成的区域；第九个突变区域位于相当于IL-2成熟蛋白基因5端开始第358个碱基到第396个碱基所形成的区域。其中，第一个区域突变的碱基数为5个；第二个区域突变的碱基数为7个；第三个区域突变的碱基数为6个；第四个区域突变的碱基数为8个；第五个区域突变的碱基数为4个；第六个区域突变的碱基数为6个；第七个区域突变的碱基数为7个；第八个区域突变的碱基数为6个；第九个区域突变的碱基数为11个。本专利技术在天然人IL-2基因的基础上通过重叠PCR对其60个碱基进行了突变(也可以利用人工合成本专利的突变基因或极类似地突变点的基因)；133个氨基酸对应的基因碱基数是399个，这60个碱基分布在9个区域；突变的碱基和突变后的碱基见表1；突变后的基因序列见序列表。表1IL-2突变位点 本专利技术具有如下优点1.重点突出，突变的位点也较少。本专利技术选取九个代表区域，是此突变基因一大特点，本突变基因没有改变天然蛋白的氨基酸序列，与天然蛋白一致；同时实现较高的蛋白表达；蛋白的表达率相当于国内外同类表达方法的表达水平。2.费用较底。本专利技术可提供直接用于生产IL-2的工程菌株。3.非化学合成。本专利技术的突变碱基是通过多次重叠PCR得到。4.本专利技术提供了并不是所有的相对大肠杆菌的稀有密码子在大肠杆菌中表达时非突变不可的证据。附图说明图1-1为突变基因工程菌测序图第一页；图1-2为突变基因工程菌测序图第二页。图2为突变基因在大肠杆菌中表达电泳图。其中A工程菌，B对照，C标准蛋白，D代表IL-2的表达带。具体实施例方式实施例1一种白介素-2突变基因，具有SEQ ID NO1所示的序列(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度399碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源白介素-2(human interleukin 2)材料菌株和E.coli DH5 α、JM109(DE3)为市购获得；质粒含有该突变获得的IL-2基因的质粒，PTE-30a-(+)表达载体，7ZTS载体(参见中国专利申请02109681.3)本实例构建(也可用市购7Z替代)；分子生物学试剂Taq DNA polymerase，Pfu DNA polymerase，dNTP，hind III，Nde I，T4 DNA Ligase皆为美国Promega公司产品，胶回收及质粒提取试剂盒都是上海华舜公司产品，琼脂糖购自FMC生物制品公司，其余产品均为国产分析纯；仪器Sprint PCR仪是英国Hybaid公司产品，离心机micromax230由IEC(International Equipment Company)公司制造，基因脉冲转化仪是Bio-Rad产品，DF-D电泳仪是北京东方特力科贸中心产品，ShimadzuDual-Wavelength TLC Sanner，CS-930。方法和结果1.各位点的突变采用重叠PCR；参考文献时成波，吕安国，吴文芳，杨立泉等，改变稀有密码子提高SEA的表达水平，《生物工程学报》2002，18(4)477-480. 2.白介素-2突变基因的鉴定1)质粒的提取参照文献《精 分子生物学实验指南》和J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》科学出版社1998年版P16-34；2)PCR引物设计及反应条件根据SEQ ID NO1所示的序列，设计一组引物正向引物(IL-2-F) 5′＞ACAATAATCATATGGCTCCGACTTCTAG＜3′反向引物(IL-2-R) 5′＞ACGGGTACCAGTCAGAGTAGAGA＜3′第一阶段97℃，1分钟；第二阶段95℃，40秒；59℃，30秒；72℃，45秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟；以含IL-2突变基因的DNA为模板进行PCR；退火温度采用50℃；反应体系参考文献J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白介素－２突变基因，其特征在于：具有序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：１中碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文芳，杨立泉，吕安国，时成波，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]