一种肝癌甲基化检测试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肝癌甲基化检测试剂及其应用，所述检测试剂包括能够特异性检测生物样本中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂。本发明专利技术提供的肝癌甲基化检测试剂可有效鉴别血浆中来源于肝组织的cfDNA。利用其定量分析性能，CHR2:25438910

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌甲基化检测试剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种肝癌甲基化检测试剂及其应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌(简称肝癌)是常见恶性肿瘤及主要肿瘤致死病因之一，主要病理学类型包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)、HCC
‑
ICC混合型肝癌，少见未分化型肝癌，其中HCC占85％～90％，具有高发病率和死亡率的特点。目前，肝癌的五年总生存率目前只有仅为11.7％～14.1％，其主要原因为大多数患者在确诊时己经为中晚期，预后较差。而对于早期肝癌(单个病灶＞2cm，或2
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3个病灶，每个病灶都≤3cm)，利用手术和放化疗联合治疗后，患者的5年生存率可超过80％。所以降低肝癌根治性治疗后复发率、提高肝癌的早期诊断率是提高患者生存率的重要措施之一。
[0003]肝癌的发生是一个多因素累积的结果。肝癌的病因包括但不限于：乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、黄曲霉素暴露、蓝绿藻类毒素污染和糖尿病等。而各种原因导致的肝硬化是原发性肝癌发生的主要危险因素，例如HBV相关肝硬化患者的肝癌年发生率达3％到6％。
[0004]在临床，肝癌早筛通常联合AFP和肝脏超声对肝癌高危人群进行定期筛查，发现异常再进一步考虑CT或者核磁共振检查。但对早期肝癌的诊断灵敏度不足，而且影像学检测只能发现直径1
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50px以上的肿块，敏感性和特异性也存在一定的局限，同时依赖医生的经验和仪器性能等因素。近年来，随着液体活检技术的发展，一些新型肝癌标志物如游离DNA(cfDNA)、微小RNA(miRNA)陆续被开发，并被证明对HCC早筛、疗效和预后评价也具有较好的应用价值。
[0005]cfDNA是血液循环中的细胞外DNA片段，主要来自机体细胞的主动或被动裂解，携带有机体细胞来源的遗传信息。而肿瘤是一种细胞水平的遗传病，其发生和表型演化与细胞内基因结构变异、表观遗传修饰及其信息网络的调控异常，包括DNA的甲基化修饰、染色质重塑和调控性非编码RNA表达异常等。肝癌中异常的甲基化作用对肝癌中基因表达调控的改变，不仅始动了而且促进了肝癌的发生发展，近年来，DNA甲基化被认为是癌症早筛的理想标记物，其信号丰富度和信号强度均较高，几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段，而体循环中新型标志物的液体活检手段也体现出更高的灵敏度和特异度，因此为肝癌早筛早诊提供理论和技术基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种肝癌甲基化检测试剂。
[0007]本专利技术还提出一种具有上述肝癌甲基化检测试剂的试剂盒。
[0008]本专利技术还提出一种上述肝癌甲基化检测试剂或试剂盒的应用。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提出了一种肝癌甲基化检测的试剂，包括能够特异性检测生物样本中以下(a)
‑
(c)中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂：
[0010](a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；
[0011](b)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；
[0012](c)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述互补序列是与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，(c)为与(a)或(b)至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述(a)或(b)中的部分区域为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于300bp。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于200bp、180bp、150bp
……
。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述部分区域的核苷酸序列中具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个
……
CpG二核苷酸位点。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述(a)或(b)中的部分区域为如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂包括核酸分子。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子包括可PCR扩增所述(a)
‑
(c)中至少一种所示核苷酸序列的引物对。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述引物对选自以下组中的至少一组：
[0023](1)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的核酸分子；
[0024](2)SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的核酸分子；
[0025](3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子包括可标记所述(a)
‑
(c)所示核苷酸序列的探针。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15中的一种或多种。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO:7所示的探针序列为与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的核酸分子相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:11所示的探针序列为与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的核酸分子相匹配的序列；所述SEQ ID NO:15所示的探针序列为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子相匹配的序列。
[0029]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针的5
’
端包含有荧光报告基团，包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
[0030]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团，包括MGB、BHQ
‑
1、BHQ
‑
2、BHQ
‑
3中的任意一种。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂还包括内参引物对和内参探针，所述
内参引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝癌甲基化检测的试剂，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中以下(a)
‑
(c)中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂：(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；(b)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；(c)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述互补序列是与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述(a)或(b)中的部分区域为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域；优选地，所述(a)或(b)中的部分区域为如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括核酸分子。5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述核酸分子包括可PCR扩增所述(a)
‑
(c)中至少一种所示核苷酸序列的引物对；优选地，所述引物对选自以下组中的至少一组：(1)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的核酸分子；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱碧银，钱振，王煜，王琳燕，传军，杨婷，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：