本发明专利技术公开了一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用，所述检测试剂包括用于检测PAX1基因甲基化的第一引物对和/或用于检测ST6GALNAC5基因甲基化的第二引物对。本发明专利技术方案制备得到的检测试剂，扩增得到的目标序列短，扩增效率高，对宫颈高级别病变和宫颈癌的检测敏感度更高，特异性更好，且可准确检出200ng DNA背景下0.5％的甲基化比率，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。适用于临床检测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用。
技术介绍
[0002]宫颈癌一直是威胁女性健康的“杀手”，在女性恶性肿瘤中，发病率仅次于乳腺癌，几乎所有(99.7％)的宫颈癌都是由于人乳头瘤病毒(HPV)持续感染所引起。HPV属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。宫颈癌的发生过程是由正常宫颈细胞感染高危型HPV病毒，然后从CIN1到CIN2到CIN3，最后进展为宫颈浸润癌。在这个过程中，CIN2后期和CIN3，特定基因甲基化异常升高，因此，通过检测特定基因甲基化的异常变化，可以评估宫颈病变的进展风险。通过特定基因甲基化检测转化性病变(部分CIN2与CIN3)时，可知道癌症进展的风险，提示医生是否立即进行治疗介入或是保持观察追踪。
[0003]癌症基因检测已是世界趋势，早期诊断出癌症的风险与发生，提早介入与干预，能够大幅地提升癌症5年生存率与降低死亡率。全世界表观遗传学研究成为最先进癌症早期诊断的重要历程碑：肿瘤的特点之一是甲基化失衡，即癌变部位特定抑癌基因甲基化程度显著增高，表达下降甚至沉默，丧失抑癌功能，最终快速发展为癌症。因此特定基因甲基化状态可以被看做肿瘤发生与发展的重要指标。因此，基因甲基化检测是未来宫颈癌全分子检查的关键，评估在短期内进展为宫颈癌的风险。因此，急需寻找并开发一种高灵敏度、高特异性的检测宫颈癌的分子标志物甲基化检测试剂，为宫颈癌的早期诊断提供有力的帮助。
技术实现思路
[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂。
[0005]本专利技术还提出一种含有上述检测试剂的试剂盒。
[0006]本专利技术还提出一种上述检测试剂、试剂盒的应用。
[0007]在本专利技术的第一方面，提出了一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂，所述检测试剂包括用于检测PAX1基因甲基化的第一引物对和/或用于检测ST6GALNAC5基因甲基化的第二引物对；
[0008]其中，所述第一引物对的核酸序列为序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物、或序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
[0009]所述第二引物对的核酸序列为序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物、或序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:11所
示的反向引物。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、和/或SEQ ID NO:10所示的荧光探针序列。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述SEQ ID NO:3所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物，或序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:7所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO:5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述SEQ ID NO:10所示的荧光探针序列为与如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物相匹配的荧光序列，或序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:11所示的反向引物相匹配的荧光序列。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光探针序列的5
’
端具有荧光基团，3
’
端具有淬灭基团；所述荧光基团为VIC、ROX、FAM、Cy5、HEX、TET、JOE、NED或TexasRed；所述淬灭基团为TAMRA、BHQ、MGB或Dabcyl。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂还包括内参引物对和内参探针，所述内参引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂用于检测PAX1基因或ST6GALNAC5基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5
‑
MeC基本上不受影响的试剂。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，本专利技术实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述水为无菌无酶水。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂针对的检测样本选自宫颈癌组织、血液、血清或血浆。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为PAX1基因和/或ST6GALNAC5基因或者PAX1基因和/或ST6GALNAC5基因的启动子区域。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为PAX1基因和/或ST6GALNAC5基因的CG富集区域或非CG富集区域。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为PAX1基因和/或ST6GALNAC5基因的CG富集区域。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂所针对PAX1基因的检测区域为如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的序列；所述检测试剂所针对ST6GALNAC5基
因的检测区域为如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21所示的序列。检测区域的选择会对肿瘤的检测效能产生影响，根据不同CG富集区域设计的引物对检测结果有明显的差异。
[0025]在本专利技术的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液为TaqMan mμLtiplex qPCR master mix。
[00本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括用于检测PAX1基因甲基化的第一引物对和/或用于检测ST6GALNAC5基因甲基化的第二引物对；其中，所述第一引物对的核酸序列为序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物、或序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；所述第二引物对的核酸序列为序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物、或序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:11所示的反向引物。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、和/或SEQ ID NO:10所示的荧光探针序列。3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括内参引物对和内参探针，所述内参引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的检测样本选自宫颈癌组织、宫颈癌脱落细胞、血液、血清或血浆。5.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1
‑
4任一项所述的检测试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照选自SiHa细胞株、Caski细胞株和...
【专利技术属性】
技术研发人员：王煜，传军，朱碧银，唐琳，王丽媛，肖长河，何庆，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。