一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的引物组合和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的引物组合及试剂盒。本发明专利技术所述的引物组合由SEQ ID NO.1～14所示的核苷酸序列组成。利用本发明专利技术引物组合可以同时检测BRAF基因、TERT基因、HRAS基因和NRAS基因的9个基因位点变异，具体为BRAF基因V600位点，TERT基因启动子C228T、C250T位点，HRAS基因G12、G13、Q61位点和NRAS基因G12、G13和Q61位点。实施例结果表明，本发明专利技术提供的引物组合能够稳定检测出1％突变的DNA样本。突变的DNA样本。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的引物组合和试剂盒
[0001]本申请是申请日为2021年01月14日、申请号为202110049147.X、专利技术名称为《一种用于评估
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I治疗分化型甲状腺癌效果的试剂盒》的分案申请。


[0002]本专利技术涉及分子生物
，具体地涉及一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的引物组合和试剂盒。

技术介绍

[0003]甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)和甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)占甲状腺癌的90％以上，由于他们在一定程度上保留了甲状腺滤泡上皮细胞的功能，如钠碘转运体(sodium iodide symporter，NIS)的表达及摄碘的能力、分泌甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)的能力、依赖于促甲状腺激素(thyroid
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stimulating hormone，TSH)生长方式等，因此，被称为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)。DTC尤其是PTC的发病率升高是致使近年来甲状腺癌发病率升高的主要因素。
[0004]131
I治疗是分化型甲状腺癌(DTC)最主要的治疗方法之一。
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I治疗分化型甲状腺癌的原理在于甲状腺细胞对碘化物具有特殊的亲和力，口服一定量的
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I后，能被甲状腺大量吸收，具有细胞杀伤作用的
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I进入甲状腺组织中，
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I在衰变时，能放射出β射线(占99％)和γ射线(占1％)，β射线在体内的有效射程比较短，仅有0.5～2毫米，能选择性地破坏甲状腺滤泡上皮而不影响邻近组织，甲状腺组织受到长时间的集中照射后，其腺体被破坏后逐渐坏死，代之以无功能的结缔组织，从而降低甲状腺的分泌功能，达到类似甲状腺次全切除术的目的。
[0005]临床数据表明，不同患者对
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I治疗的敏感性存在一定差异，具体表现在有些患者对
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I治疗敏感，但有一部分患者则表现出对
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I治疗的抵抗。随着分子生物学技术的发展，发现
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I治疗的敏感性差异产生的背后有不同基因发生变异的基础。例如，《持续/复发及转移性甲状腺癌诊疗指南》(中国临床肿瘤学会(CSCO)，2018.V1)指出，甲状腺乳头状癌(PTC)原发灶的BRAF基因V600E突变及TERT基因启动子突变与远处转移灶的摄碘能力下降有关，导致碘吸收能力的下降，碘治疗受益的可能性小，但到目前为止这些专家共识或诊疗指南中并没有明确TERT基因上具体有哪些启动子区域影响了摄碘能力。通过大量的临床研究，我们发现携带TERT基因启动子C228T和C250T位点突变的甲状腺乳头状癌患者，对碘的吸收能力下降，术后应用
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I放射治疗欠佳。
[0006]此外，虽然也有研究发现在具有乳头状核特征的甲状腺滤泡状癌中，携带NRAS基因突变的患者，其接受
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I治疗的获益可能性较大，但对于RAS基因的其他亚型是否和
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I的治疗效果有关，尚未有明确定论。经研究，我们发现HRAS基因上G12/G13/Q61区域的突变和
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I的治疗效果密切相关，但KRAS基因上该突变和
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I的治疗效果不相关。
[0007]因此为了很好地区分对
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I治疗的敏感性的患者，临床上亟需一种准确率高的方
法用于评估
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I治疗分化型甲状腺癌的效果，从而实现对患者的精准治疗。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地评估
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I治疗分化型甲状腺癌效果的试剂盒，为临床医生在决定是否对分化型甲状腺癌患者使用
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I治疗之前或在治疗过程中是否需要改变
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I的放射剂量提供参考。使用本专利技术方法，可以同时检测4个基因的9个突变位点，所述9个突变位点分别如表1所示：
[0009]表1基因名称和突变位点表
[0010]基因检测位点/区域BRAFV600TERTC228T/C250THRASG12/G13/Q61NRASG12/G13/Q61
[0011]本专利技术还提供了一种能够特异性扩增甲状腺癌预后相关基因突变的引物组合，包括如下扩增引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的BRAF基因扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的TERT基因扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的HRAS基因扩增引物对，SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的NRAS基因扩增引物对；核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的通用测序引物对。特异性多重PCR引物序列见表2所示。
[0012]表2引物序列表
[0013][0014]注：N代表A或T或G或C任意碱基。
[0015]本专利技术还提供了一种用于检测分化型甲状腺癌
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I疗效相关基因突变的试剂盒，所述的试剂盒包含：特异性多重PCR引物、NGS建库试剂、阳性对照、阴性对照、无核酸酶水。NGS建库试剂为本领域常规使用试剂，能够从市场购买。
[0016]优选地，所述NGS建库试剂可以选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒(Illumina)。
[0017]优选地，所述阳性对照为BRAF基因V600E突变的人类基因组DNA储存液。
[0018]优选地，所述阴性对照为经确认不包含本专利技术所述基因变异的健康人类基因组DNA储存液。
[0019]所用的样本为检测对象的甲状腺癌实体组织。
[0020]优选地，所用的样本可以是新鲜手术组织和/或穿刺组织、冷冻手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本中的一种或多种。更优选地，检测样本为新鲜手术组织和/或穿刺组织。
[0021]一种用于评估
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I治疗分化型甲状腺癌效果的试剂盒，其检测流程包括如下步骤：
[0022](1)样本提取：使用DNA样本抽提试剂盒提取样本中的DNA；
[0023](2)多重PCR扩增：用特异性多重PCR引物与NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤(1)中获得的DNA进行扩增；
[0024](3)产物纯化：在步骤(2)获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠，进行纯化，去除基因组DNA和残余扩增引物；
[0025](4)接头连接：在步骤(3)获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的引物组合，其特征在于，由SEQ ID NO.1～14所示的核苷酸序列组成。2.权利要求1所述的引物组合在制备检测分化型甲状腺癌基因突变的试剂盒中的应用；所述分化型甲状腺癌基因突变的位点包括BRAF基因V600位点，TERT基因启动子C228T、C250T位点，HRAS基因G12、G13、Q61位点和NRAS基因G12、G13和Q61位点。3.一种用于检测分化型甲状腺癌基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括NGS建库试剂、阳性质控品和阴性质控品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述NGS建库试剂含有DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris
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HCl、dNTPs、通用引物和接头；所述阳性质控品为正常人基因组DNA，所述阴性质控品为无核酸酶水。6.根据权利要求3所述的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣涛，张宇清，裴婷婷，
申请(专利权)人：润安医学科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：