本公开涉及一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒，具体涉及采用特异性上游引物(跨越13号和15外显子，并在15号外显子引入dI修饰)、下游引物和探针，以及内参基因评估样本中MET基因14号外显子跳跃突变的发生情况。本方法所引入的[dI]修饰使反应体系具有高灵敏度和特异性，仅扩增突变型模板，大大降低假阳性的发生率，提高检测效率。提高检测效率。
【技术实现步骤摘要】
检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒
[0001]本公开属于生物基因检测领域，具体为一种检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒，以及检测方法。
技术介绍
[0002]MET也称为c
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MET(cellular
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mesenchymal to epithelial transition factor)，是位于人染色体7上的原癌基因，也是受体酪氨酸激酶家族的成员之一，具有酪氨酸激酶活性。MET受体与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)结合，可诱导MET二聚体处于激活状态，从而产生磷酸化，激活了下游信号通路。这种的异常活化会造成多方面的影响：包括细胞生长、侵袭及转移等。持续的信号传递会造成细胞过度增殖，因此导致肿瘤的发生与进展。MET通路的异常激活有多种类型，包括MET基因14号外显子跳跃突变、MET扩增、MET重排和MET蛋白过表达等。MET基因14外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的总发生率为3％
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6％，在肺腺癌中的发生率为3％
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4％，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22％。另外其他癌症类型如胃癌，结直肠癌，脑胶质瘤都发现了MET基因的14号外显子跳跃突变。同时研究发现，克唑替尼治疗MET基因14号外显子突变的晚期肺癌有显着和持久的反应(肿瘤部分缓解)，其后陆续有多个MET靶向药治疗MET基因14号外显子跳跃突变的晚期肺癌疗效良好的案例报道，例如卡博替尼、卡马替尼(INC280)、特普替尼、Tivantinib(ARQ197)、Amuvatinib(MP
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470)、Foretinib(XL880)、Rilotumumab(AMG102)、Ficlatuzumab(AV
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299)、Onartuzumab(Metmab)(参见Li Anna,et al.Expert Opinion on Therapeutic Targets,2014,19(5),663
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674；Joseph J.Sacco,et al.Translational Lung Cancer Research,2015,4(3):242
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252；Koichi Azuma,et al.Journal of Clinical Oncology,2014,32(15):8044；Osamu Maeda,et al.The New England Journal of Medicine,2018,379:1384
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1385；Yi
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Long Wu,et al.Journal of Clinical Oncology,2014,32(15):8017；Anthony Markham,Drugs,2020,80:829
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833；K.K.Sankhala,et al.Journal of Clinical Oncology,2011,29(15):3074；Daniel Rayson,et al.Journal of Clinical Oncology,2012,30(15),1036；Kimberly Perez,et al.Journal of Clinical Oncology,2020,38(4):693；David R Spigel,et al.Journal of Clinical Oncology,2017,35(4):412
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420.)。MET基因14号外显子跳跃突变已成为靶向治疗非小细胞肺癌的重要靶点。
[0003]目前MET基因14外显子跳跃突变检测主要应用的是NGS、一代测序或者荧光PCR。NGS是目前获得美国NCCN指南推荐的MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法。但是它的检测过程繁琐，需要较长的建库和检测周期，而且实验数据庞大，需要专业的生物信息人员进行筛选与分析，无法形成标准化的分析流程。同时检测的价格也是相当昂贵，对患者造成很大的经济负担。此外，一代测序灵敏度不足，荧光PCR检测特异性或灵敏度不足。因此，需要一种能够快速、精准、高效地检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒及方法，从而支持患者后续的靶向精准治疗。
技术实现思路
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种新的精准检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，具有较高的特异性和灵敏性，该试剂盒中的上游引物能有效阻断检测体系中的野生型模板扩增，仅扩增突变型模板，有效避免假阳性结果，提高检测准确性。
[0005]为了实现上述目的，本公开采用以下具体方案：
[0006]在一方面，本公开提供了一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其包括样本检测引物和检测探针，所述检测引物包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自SEQ ID NO.1
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7任一所示的核苷酸序列，所述下游引物选自SEQ ID NO.8
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11任一所示的核苷酸序列，所述检测探针选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
[0007]在另一方面，本公开提供了一种体外检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：
[0008](1)从待测样本中获取RNA并逆转录为cDNA；
[0009](2)将步骤(1)获取的cDNA、前述的用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针以及任选的内参混合；
[0010](3)进行PCR反应；
[0011](4)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧光信号判定检测样本中是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。
[0012]在另一方面，本公开提供了一种利用前述试剂盒或检测方法在针对MET基因14号外显子跳跃突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014](1)本公开提供了一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的引物与探针，具有较高的特异性和灵敏性，最低可以检测到15copy/μL突变型模板。
[0015](2)本公开通过设计一种位于MET基因13号和15号外显子交界处(跨13和15号外显子)且15外显子5
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端带有dI修饰的上游引物，有效阻断检测体系中的野生型模板扩增，仅扩增突变型模板，有效避免假阳性结果，提高检测准确性。
[0016](3)本公开的检测方法简单安全，检测速度快，用荧光PCR方法检测可在2小时内完成，数字PCR方法检测可在2.5
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3小时内完成。
附图说明
[0017]图1示出了带有dI修饰的上游引物1036对应的扩增和熔解曲线。
[0018]图2示出了带有spacer C3修饰的上游引物1041对应的扩增和熔解曲线。
[0019]图3示出了不带修饰的上游引物930对应本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其包括检测引物和检测探针，所述检测引物包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自SEQ ID NO.1
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7任一所示的核苷酸序列，所述下游引物选自SEQ ID NO.8
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11任一所示的核苷酸序列，所述检测探针选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；优选地，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内参，所述内参包括内参上游引物、内参下游引物和内参检测探针；优选地，所述内参上游引物包括SEQ ID NO.15所示的内参上游引物；优选地，所述内参下游引物包括SEQ ID NO.18所示的内参下游引物；优选地，所述内参检测探针包括SEQ ID NO.20所示的内参检测探针。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述样本检测探针和内参探针的非端点序列具有或不具有修饰；优选地，所述样本检测探针和内参探针的非端点序列不具有修饰；优选地，所述修饰选自锁核酸修饰、肽核酸修饰或MGB修饰的一种或多种。4.根据权利要求1
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3任一项所述的试剂盒，其中，所述的样本检测探针和内参探针的5
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端修饰有荧光基团和/或3
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端修饰有淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自以下中的一种：FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY
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5、HEX或CY
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3；优选地，所述淬灭基团选自以下的一种：TAMRA、BHQ
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2、Dabcyl或MGB。5.体外检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：(1)从待测样本中获取RNA并逆转录为cDNA；(2)将步骤(1)获取的cDNA、权利要求1
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4所述的用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针以及任选的内参混合；(3)进行PCR反应；(4)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐盼盼，唐东江，黄雅菁，
申请(专利权)人：珠海圣美生物诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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