用于检测BCR-ABL1基因T315I突变的引物对、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测BCR

【技术实现步骤摘要】
用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，相应的试剂盒，以及在BCR
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ABL1基因T315I突变检测中的应用，属于分子生物学领域的基因检测


技术介绍

[0002]慢性髓细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种发生在多能干细胞的恶性骨髓增殖性肿瘤，初诊时多为慢性期(chronic phase，CP)，如不及时干预治疗，经数月或数年可发展到加速期(accelerated phase，AP)和急变期(blastic crisis，BC)，导致骨髓可见大量原始细胞浸润并增殖或伴发髓外浸润，使患者生存期短，预后差，很难被有效治愈。其分子机制是9号染色体上的ABL原癌基因与22号染色体片段上的断裂点簇集区域(BCR)相互易位形成费城染色体(Philadelphia chromosome，Ph1染色体)所产生的BCR
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ABL1融合基因。该融合基因可编码具有异常增高的酪氨酸蛋白激酶活性的P210蛋白，激活包括RAS、MAPK、PI3K/AKT，STAT5等多条下游信号通路，导致恶性CML细胞的无限持续增殖并不断积累，使CML最终进入BC期，成为难治性白血病。
[0003]酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKIs)能靶向抑制酪氨酸蛋白激酶活性，抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡，最终使患者获得长期深度分子缓解(BCR
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ABL1融合基因水平降低至阴性)，有效长期缓解患者症状，极大改善患者预后。伊马替尼(imatinib，IM)作为首个被批准于用于治疗CML的TKI药物，可将CML患者10年总生存率从小于20％提高到92％。第二代TKIs，如达沙替尼(dasitainib)、尼洛替尼(niluotinib)、博舒替尼(bosutinib)等可使疾病获得更快更深的分子水平缓解。但随着TKI类药物广泛应用于临床，其耐药性问题也逐步突显。TKIs耐药机制复杂多样，其中，BCR
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ABL1在激酶结构域出现的点突变，是继发性耐药的最常见原因，占伊马替尼耐药的30～70％。其主要机制是BCR
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ABL1的耐药突变可影响激酶构象的稳定性，使其由非活性构象向活性构象转化，从而阻碍靶向药物与激酶靶位点的有效结合，导致TKIs耐药，影响治疗效果。
[0004]目前已经发现的突变类型一共有几十种，其中临床应用中最受关注的是T315I突变，一方面是因为它比其它突变类型具有更大的耐药性和预后风险，能破坏一代和二代的多种TKIs的治疗效果，被称为“gatekeeper residue”；另一方面是因为这一区域的GC含量过高，难以设计引物分析，且存在临近位点突变(如T315A等)，会干扰T315I突变分析的准确性和灵敏度。
[0005]目前，在临床实验室检测BCR
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ABL1耐药突变的分析技术中，已经有多种技术报道。其中，桑格测序(Sanger Sequencing,SS)是应用最广泛的金标准，其主要流程是对患者骨髓或外周血标本抽提RNA、逆转到cDNA后，采用巢式PCR扩增，第一轮扩增包含ABL激酶区的BCR
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ABL融合基因，第二轮扩增第一轮产物中的ABL激酶区，然后进行桑格测序。但是，桑格测序的主要问题为敏感性低：灵敏度为15％～20％，对突变频率低于15％的样品无法准确检测，因而容易造成漏检，将微量耐药突变的样本会被认为是阴性而无法检出，产生隐匿性突变。
[0006]扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)通过设计3
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端特异性识别突变碱基的引物，可阻碍正常位点扩增而降低其干扰，实现突变位点的有效扩增和特异性检测。其具有简便快速，特异性好，技术普及度高等特点，非常适合医院广泛开展应用和检测试剂盒的开发。但是，ARMS技术由于灵敏度不够无法满足检测需求而限制了其临床应用。
[0007]二代测序(next
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generation sequencing，NGS)是在桑格测序的基础上发展起来的，其也采用巢式PCR方式，对第二轮PCR产物构建测序文库，锚定桥接，单碱基延伸测序和数据分析，通过增加测序深度，反复多次扫描可提高突变检测的灵敏度，其灵敏度可达1％～2％，可揭示复杂的突变信息。但是，二代测序的主要问题是建库技术复杂、成本很高、测序数据处理时间较长(需1
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2周)，难以在临床大规模应用。
[0008]数字PCR(Digital PCR,dPCR)是将样品分配为成千上万个微滴，实现对样品中待测组分的高灵敏检测和绝对定量的技术。主要流程是通过对ABL激酶区的进行PCR扩增后，PCR产物直接进行数字定量PCR检测。目前对BCR
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ABL1耐药突变检测的dPCR技术中，已有的报道是利用Fluidigm的BioMark微流控芯片系统，通过高成本的微刻蚀技术构建39,960个反应微腔，将样品分配后，根据泊松分布，实现每个微腔中单分子PCR扩增和绝对定量。但Fluidigm的BioMark平台的成本很高，难以普及应用。相比于BioMark微流控dPCR系统，Bio
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Rad的半自动和全自动的QX200微滴式数字PCR(ddPCR)系统通过在油水界面自动生成液滴的方式，显著降低了分析的成本。而且，ddPCR一般是通过设计不同的Taqman
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MGB探针以区分突变位点与正常位点，目前无法解决BCR
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ABL1耐药的组合突变相互干扰的问题，在对特定突变如T315I的分析中也存在困难。

技术实现思路

[0009]本专利技术的主要目的在于提供一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对、探针，相应的试剂盒，以及在BCR
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ABL1基因T315I突变检测中的应用，以克服现有技术中的不足。
[0010]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0011]本专利技术实施例提供了一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的3
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端的第3和/或第4个碱基引入对应的错配碱基，所述引物的3
’
端的第2个碱基引入脱碱基位点，所述引物的3
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端的末端碱基是经过锁核酸修饰的。
[0012]本专利技术实施例还提供了一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的探针，其具有SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的序列。
[0013]本专利技术实施例还提供了一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物的3
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端的第3和/或第4个碱基引入对应的错配碱基，所述引物的3
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端的第2个碱基引入脱碱基位点，所述引物的3
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端的末端碱基是经过锁核酸修饰的。2.根据权利要求1所述的用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，其特征在于：所述上游引物具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4中至少任一者所示的序列，优选为SEQ ID No.1。3.根据权利要求1所述的用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，其特征在于：所述下游引物具有SEQ ID No.7所示的序列。4.一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的探针，其特征在于：所述探针具有SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的序列。5.一种用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3中任一项所述的用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的引物对，以及权利要求4中所述的用于检测BCR
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ABL1基因T315I突变的探针。6.一种非诊断目的的BCR
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ABL1基因T315I突变的检测方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炯，刘胜权，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：