数字制造技术

本申请提供数字

【技术实现步骤摘要】
数字PCR联合检测MET基因扩增和EGFR基因扩增的引物和探针、试剂盒、检测试剂


[0001]本申请涉及基因检测
，尤其涉及数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针
、
试剂盒
、
检测试剂
。

技术介绍

[0002]MET
是间质表皮转化因子即
c
‑
MET(cellular
‑
mesenchymal to epithelial transition factor)
基因的缩写
。MET
基因位于7号染色体长臂
(7q21
‑
31)
上，包含
21
个外显子
。MET
基因编码的
c
‑
MET
蛋白是肝细胞生长因子
(HGF)
的酪氨酸激酶受体，
HGF
与
c
‑
MET
结合激活下游信号通路，促进细胞增殖
、
生长
、
迁移
、
血管生成
。
当
MET
基因出现异常，就会持续激活相关信号通路，使癌细胞不断增殖和转移
。
目前较有希望作为肺癌靶向治疗靶点的驱动性
MET
基因异常为
MET
外显子
14
突变和
MET
基因扩增，非小细胞肺癌
(non
‑
smallcelllungcancer
，
NSCLC)
中原发
MET
基因扩增发生比例为1％～5％
。
[0003]MET
基因扩增是指该基因拷贝数
(gene copy number
，
GCN)
增加，从而导致
MET mRNA
水平上调，进一步增加
MET
蛋白表达，从而增加激活状态的
MET
通路信号
。MET
基因扩增与较高的组织学分级
、
较晚的临床分期以及不良预后相关
。MET
基因扩增更常继发于其他驱动基因阳性
NSCLC
患者靶向治疗后，是
EGFR
‑
TKI
耐药的重要机制之一
。
继发
MET
基因扩增在
EGFR
信号通路被
EGFR
‑
TKI
抑制时，作为旁路信号途径绕过
EGFR
激活下游通路导致耐药
。MET
基因扩增也是
ALK
‑
TKI
耐药机制之一，第二
、
三代
ALK
‑
TKI
耐药后
MET
基因扩增的比例约为
13
％
。
临床研究数据表明，
EGFR
‑
TKI
联合
MET
抑制剂可能是继发
MET
基因扩增导致的
EGFR
‑
TKI
耐药患者的潜在治疗策略
。
另有报道显示，
ALK
‑
TKI
耐药后发生
MET
基因扩增的患者应用
MET
抑制剂治疗也取得了一定的疗效
。
[0004]EGFR
扩增是指
EGFR
基因拷贝数的增加
。
研究显示，
EGFR
扩增在
NSCLC
患者中的发生率约为9–
64
％
。
研究表明，
EGFR
拷贝数增加与肿瘤进展相关，
EGFR
扩增是脑转移患者进展的危险因素
。
另外，
EGFR
扩增也是
EGFR
‑
TKI
的耐药机制之一
。
[0005]对肺癌患者外周血样本进行
EGFR
，
MET
基因扩增状态的检测，可以作为组织样本检测的有效补充，通过对外周血样本的1次或多次检测，避免因为时空异质性带来的假阴性结果，适用于肺癌患者伴随诊断和动态监测
。
通过外周血样本检测结果对病人基因突变状态进行动态监测，可早于实体瘤疗效评价标准
(Response Evaluation Criteria in Solid Tumor
，
RECIST)
评估的影像学进展，也可提示临床医师积极调整治疗策略，避免患者错过靶向治疗的最佳时机
。
[0006]现有的
EGFR
，
MET
基因扩增状态常用
FISH
检测和
NGS
检测，
FISH
检测是现有基因扩增检测的金标准，但是也存在以下缺点：
(1)
准确性受不同抗体间敏感性，不同观察者间判读标准的差异性影响，对于低扩增倍数的样本易出现假阴性；
(2)
仅能用于组织样本，肿瘤的时空异质性决定了组织活检不能完全反映肿瘤中基因状态，并且因为穿刺的局限性，也导致无法随着患者治疗的进展而进行多次组织活检；
(3)
操作流程复杂，检测周期长
。NGS
检
测技术可以一次性精准，全面识别多种变异类型，同时可用于外周血样本的检测，对于无组织样本的患者可实现基于各类体液样本的液体活检技术
。
但是
NGS
检测周期较长；价格高；定量效果受限于建库质量，无法准确定量样品扩增倍数
。

技术实现思路

[0007]本申请的目的在于提供数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针
、
试剂盒
、
检测试剂，以解决上述问题
。
[0008]为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：
[0009]本申请首先提供数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针，包括：用于检测
MET
基因扩增的上下游引物和
MET
基因扩增的检测探针，用于检测
EGFR
基因扩增的上下游引物和
EGFR
基因扩增的检测探针，以及用于检测内参基因扩增的上下游引物和内参基因扩增的检测探针；
[0010]其中，用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针，其特征在于，包括：用于检测
MET
基因扩增的上下游引物和
MET
基因扩增的检测探针，用于检测
EGFR
基因扩增的上下游引物和
EGFR
基因扩增的检测探针，以及用于检测内参基因扩增的上下游引物和内参基因扩增的检测探针；其中，用于检测
MET
基因扩增的上游引物选自
SEQ ID NO.1、3、5、7
任一所示的核苷酸序列，下游引物选自
SEQ ID NO.2、4、6、8
任一所示的核苷酸序列，
MET
基因扩增的检测探针为
SEQ ID NO.23
所示的核苷酸序列；用于检测
EGFR
基因扩增的上游引物选自
SEQ ID NO.9、11、13、15
任一所示的核苷酸序列，下游引物选自
SEQ ID NO.10、12、14、16
任一所示的核苷酸序列，
EGFR
基因扩增的检测探针为
SEQ ID NO.24
所示的核苷酸序列；优选地，用于检测
MET
基因扩增的上游引物为
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列，用于检测
MET
基因扩增的下游引物为
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列；用于检测
EGFR
基因扩增的上游引物为
SEQ ID NO.9
所示的核苷酸序列，用于检测
EGFR
基因扩增的下游引物为
SEQ ID NO.10
所示的核苷酸序列
。2.
根据权利要求1所述的数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针，其特征在于，所述内参基因包括
ERV3
，所述引物和探针还包括：用于检测内参
ERV3
基因扩增的的上下游引物和
ERV3
基因扩增的检测探针；其中，用于检测内参
ERV3
基因扩增的上游引物选自
SEQ ID NO.17、19、21
任一所示的核苷酸序列，下游引物选自
SEQ ID NO.18、20、22
任一所示的核苷酸序列，
ERV3
基因扩增的检测探针为
SEQ ID NO.25
所示的核苷酸序列；优选地，用于检测内参
ERV3
基因扩增的上游引物为
SEQ ID NO.19
所示的核苷酸序列，用于检测内参
ERV3
基因扩增的下游引物为
SEQ ID NO.20
所示的核苷酸序列
。3.
根据权利要求2所述的数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针，其特征在于，所述内参基因还包括
EIF2C1
，所述引物和探针还包括：用于检测内参
EIF2C1
基因扩增的上游引物为
SEQ ID NO.26
所示的核苷酸序列，用于检测内参
EIF2C1
基因扩增的下游引物为
SEQ ID NO.27
所示的核苷酸序列，内参
EIF2C1
基因扩增的检测探针为
SEQ ID NO.28
所示的核苷酸序列
。4.
根据权利要求1至3任一项所述的数字
PCR
联合检测
MET
基因扩增和
EGFR
基因扩增的引物和探针，其特征在于，所述
MET
基因扩增的检测探针
、
所述
EGFR
基因扩增的检测探针和所述内参基因扩增的检测探针均为经过荧光标记的，其5’
端标记有报告基团，3’
端标记有淬灭基团；或，其5’
端标记有淬灭基团，3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雅菁，唐东江，
申请(专利权)人：珠海圣美生物诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：