一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用。海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所述的海洋酯酶H8能在20～40℃和pH 6.0～9.0范围内保持很高的短链酯类降解酶活力，为广泛应用于工业生产中奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用，属于生物技术

技术介绍
酯类水解酶(lipolyticenzymes)，包括酯酶(esterases)和脂肪酶(lipases)，广泛存在于动物、植物和微生物中。相较于动植物来源的酯酶，微生物来源的酯酶不仅种类多、来源广和作用高效，并且利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯类水解酶应用最多。酯类水解酶能够催化酯键的水解和合成。酯酶通常作用于水溶性的短链酯类，而脂肪酶则通常水解难溶的长链甘油三酯。酯类水解酶具有很好的区域选择性和立体选择性，能在非水相体系中发挥作用，同时不需要额外的辅因子帮助催化，且底物作用谱广等优点，这使得酯类水解酶广泛应用于洗涤剂、化妆品、造纸业、食品工业、农业和医药化学等领域。在这些工业应用中，酯类水解酶通常处于高温、高盐以及存在有机溶剂等不利条件中。因此，对热稳定的、耐盐的和/或耐有机溶剂的酯类水解酶的研究和开发逐渐成为研究热点。一般来说，耐盐酶的蛋白表面存在大量带负电荷的酸性氨基酸，这些酸性氨基酸能够与溶剂中水合离子相互结合在蛋白表面形成一个保护性的水合盐离子网络，从而使酶蛋白在高盐条件下保持可溶和折叠状态，维持正常的结构和功能。因此，耐盐酶在需要高盐和低水活的工业应用中发挥重要作用。根据生化性质和氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶主要分为8个家族，第I-VIII家族。其中，第V家族以酯酶为主，这一家族酯酶在适冷菌、中温菌和嗜热菌中均有报道。第V家族酯酶在结构上类似于非酯类水解酶—环氧化物水解酶、脱卤酶和卤过氧化物酶等，后者也具有典型的α/β水解酶折叠结构。该家族已经有多个酶蛋白被表征，但是有关这一家族耐盐性的研究到目前为止还没有报道。海洋是一个开放、多变、复杂的生态系统。海洋微生物不仅数量巨大，而且富含多种类群，其处于不同的温度、压力、盐浓度、营养物质等环境条件下，这为获取独特性质的具有工业潜力的新酶提供了巨大的来源。而宏基因组技术的应用，使得从各种环境资源中获取有工业潜力的新型酯类水解酶成为可能。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用。一种海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述基因编码的海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶H8。本专利技术海洋酯酶的基因H8来自南海深海沉积物样品S100宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5的大片段质粒fosmidDNA。通过构建P43-H5克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因H8的核酸序列。根据H8基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从P43-H5克隆子的fosmidDNA克隆了编码海洋酯酶H8的基因，构建了含海洋酯酶基因H8的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。测序结果表明海洋酯酶基因H8为一个含有918个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码305个氨基酸。因此酯酶H8是一个含有305个氨基酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶H8属于酯类水解酶第V家族。对纯化的海洋酯酶H8进行性质测定。结果表明该酶对短链的酯类(C4-C10)表现出较强的降解活性。最适pH为10.0，且在pH6.0～9.0范围内稳定存在。最适酶活温度为35℃，且在20～40℃范围内保持超过80％的活力。H8在高浓度的NaCl中具有较高的酶活性，且对高浓度的NaCl表现出很好的耐受性，是耐盐酶。上述海洋酯酶H8在水解碳链长度为4～10的短链酯类中的应用。有益效果1、本专利技术所述的海洋酯酶H8能在20～40℃和pH6.0～9.0范围内保持很高的短链酯类降解酶活力，为广泛应用于工业生产中奠定了基础；2、本专利技术所述的海洋酯酶H8在高盐中保持较高的酶活力，且对高盐表现出很好的耐受性，可以在需高盐和低水活的工业应用中发挥作用。附图说明图1、以海洋酯酶H8及其同源序列以及已知的酯类水解酶第V家族序列构建的系统发生树；图2、通过PCR扩增克隆的编码海洋酯酶H8的基因片段的电泳图；其中：泳道1为扩增的DNA片段，M泳道为DNA分子量标记(marker)；图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的海洋酯酶H8电泳图；其中：1、经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶H8电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；图4、海洋酯酶H8的底物特异性分析；图5、海洋酯酶H8的酶活温度曲线；其中：A、温度对酶活性的影响，B、温度对酶稳定性的影响；图6、海洋酯酶H8的酶活pH曲线；其中：A、pH对酶活性的影响，B、pH对酶稳定性的影响；图7、不同浓度的NaCl对海洋酯酶H8酶活性的影响曲线；其中：A、NaCl对酶活性的影响，B、NaCl对酶稳定性的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。培养基：LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。实施例1：海洋酯酶H8编码基因序列的获取及其序列分析菌种来源：南海深海沉积物样品S100宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5。具体步骤如下：1.1亚克隆文库的构建用OMEGA公司的BAC/PACDNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取1,500～5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及经碱性磷酸酶去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coliTop10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子P43-H5的fosmidDNA的亚克隆文库。1.2酯类水解酶基因序列的确定选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并以载体特异性引物M13F/R进行测序。用GeneMark软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBInr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子P43-H5上携带的酯酶基因序列H8，基因H8共918bp，其中含有一个918bp的开放阅读框架，其编码海洋酯酶H8，起始密码子位于1bp，终止密码子位于916bp，共编码305个氨基酸。获得的海洋酯酶H8编码基因H8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。海洋酯酶H8的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。1.3海洋酯酶H8的序列分析GenBank中，与海洋酯酶H8最相似的序列为来源于Alcanivoraxsp.的α/β水解酶(WP_062817123.1)，序列相似性为99％。该蛋白是基于基因序列预测的，其生化性质尚未被研究。在已表征过的酯类水解酶中，与海洋酯酶H8最相似的序列为第V家族的酯酶Est本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述海洋酯酶基因H8编码的海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀兰，张祎，李平一，张玉忠，秦启龙，苏海楠，石梅，李春阳，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37