表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体(CAR)以及相关的核酸、表达载体、脐血有核细胞、注射液。本发明专利技术所述的表达CAR的脐血有核细胞可通过CAR靶向EGFRvIII抗原，高效杀伤EGFRvIII阳性肿瘤细胞，可用于制备预防和治疗多种EGFRvIII阳性肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对表达EGFRvIII阳性肿瘤的转基因细胞治疗领域。
技术介绍
过继免疫治疗是将自体或异体抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外用IL-2、抗CD3单抗等诱导、激活和扩增，然后转输给患者，以达到治疗和预防复发的目的。目前已经开发出CTL、NKT、γδT、TIL、CIK、DC-CIK、CAR-T等多种过继免疫疗法，然而这些过继免疫疗法在疗效及副作用上仍具有较大的挑战。CAR-T免疫疗法为最新技术，移植细胞可在体内扩增近千倍且存活长达6个月并持续表达抗原受体。在临床上显示出很好的疗效，在血系肿瘤，有47项相关报道，均取得了显著的治疗效果。然而，CAR-T在治疗实体瘤上并未取得理想的临床疗效。另外，目前发现的肿瘤特异性抗原(TSA)较少，CAR-T细胞治疗大多数靶向肿瘤相关抗原(TAA)，肿瘤相关抗原在其它正常组织中也表达，因此，CAR-T治疗常常伴随着严重的脱靶细胞会攻击正常细胞而给患者带来新的损伤。此治疗常常伴随着严重的脱靶效应，CAR-T细胞攻击正常细胞而给患者带来新的损伤。EGFRvIII是一种表皮生长因子受体的突变型，该突变体在细胞表面表达，是肿瘤特异性抗原(TSA)，其可在50％-60％的胶质母细胞瘤，70％-80％的乳腺及卵巢癌及大约16％肺癌中表达(Wikstrand等，CancerRes.55:3140-3148(1995))，是肿瘤治疗中极富吸引力的靶部位。目前，诸多学者已经制备出针对EGFRvIII的CAR-T细胞，在体外杀伤试验及动物试验中取得了一定的疗效，然而，其在临床试验中并未取得理想的疗效。原因可能有以下几点，首先，恶性肿瘤细胞存在高度的异质性，同一患者中的肿瘤细胞并非都表达此抗原，灭杀单一类型的细胞并不能够根治肿瘤；其次，肿瘤患者体内T细胞长期受肿瘤细胞逃避机制的影响，其在遗传学上可能存在一定的缺陷，其杀伤作用可能降低；再次，肿瘤患者免疫功能低下，单一的CAR-T细胞移植虽然能够杀伤特异性肿瘤细胞，然而其未必能够重建患者免疫功能，提高患者对肿瘤的免疫功能。CAR-T细胞治疗在血系肿瘤良好的治疗效果也预示着其治疗实体瘤的潜能，诸多学者不断地对CAR-T细胞进行改进以期在实体瘤治疗中取得突破。本专利技术使用脐血有核细胞作为宿主细胞，通过慢病毒转染使其表达CAR，在对野生型EGFRvIII阳性细胞的体外杀伤及EGFRvIII阳性胶质瘤动物肿瘤治疗中取得了良好的效果。脐带血中淋巴细胞相对不成熟，抗原性较弱，而且脐血中还富含造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞等多种原始细胞，在肿瘤治疗中可能具有更长期持久的疗效。另外脐带血是废弃的血源，对供体没有负担，来源广泛，易于收集和保存；将有望成为通用型肿瘤治疗产品。
技术实现思路
本专利技术的目的首先是构建一种嵌合抗原受体(CAR)。本专利技术所述的嵌合抗原受体(CAR)为一段融合多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；所述CAR包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域；所述抗原识别结构域包括针对表皮生长因子受体3号突变体(EGFRvIII)的单克隆抗体或其可变区或其抗原的结合区域。根据本专利技术所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述抗原识别结构域包括：IgGκ信号肽、以连接肽连接重、轻链形成的单链抗体片段(scFv)；所述抗原识别结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:2；所述IgGκ信号肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3；所述单链抗体片段(scFv)的氨基酸序列为SEQIDNO:4。根据本专利技术所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述跨膜结构域包括：铰链结构以及跨膜区；所述跨膜结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:5；所述铰链结构的氨基酸序列为SEQIDNO:6；所述跨膜区的氨基酸序列为SEQIDNO:7。根据本专利技术所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述细胞内T细胞信号传导结构域包含CD137和CD247；所述细胞内T细胞信号传导结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:8；所述CD137的氨基酸序列为SEQIDNO:9；所述CD247的氨基酸序列为SEQIDNO:10。本专利技术还提供了一种核酸分子。所述核酸分子编码本专利技术所述的嵌合抗原受体(CAR)。本专利技术还提供了一种表达载体。所述表达载体含有本专利技术所述的核酸分子。此载体能够高效转导脐血有核细胞并在其中稳定表达。本专利技术设计了编码靶向EGFRvIII抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核酸MD1-1-CD8α-CD137-CD247(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，其中MD1-1编码高亲和结合EGFRvIII的单链抗体(scFv)，其由MD1突变形成。CD8α编码铰链及跨膜结构，CD137、CD247编码T细胞激活及信号传导结构。然后，将此核酸连接到Fuw载体(Fuw空载体由中国科学院广州生物医药与健康研究院惠赠)构建了慢病毒表达载体Fuw-IgGk-MD1-1-CD8α-CD137-CD247及其同型对照载体Fuw-EGFP，将该载体转染293T细胞包装病毒，在本专利技术的一个实施方案中，每一个10cm皿的293T细胞可包装滴度为2×108TU的病毒，病毒可进行冻存，复苏后细胞滴度将下降为原来的50％左右。本专利技术还提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞。本专利技术所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞含有本专利技术所述的核酸分子，或者含有本专利技术所述的载体，所述核酸分子通过病毒、脂质体、电转染或转座子系统转染至脐血有核细胞，在靶细胞表达为嵌合抗原受体(CAR)。优选地，所述脐血有核细胞来源于人或动物脐血，是通过梯度密度离心、流式分选、免疫磁珠分选方法分离获得的有核细胞群，包括：T细胞、杀伤细胞、造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞。本专利技术还提供了所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞的用途。本专利技术所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞可用于制备治疗或预防神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的药物，该药物能通过CAR靶向EGFRvIII抗原，高效杀伤肿瘤细胞的细胞群，例如靶向杀伤EGFRvIII阳性肿瘤细胞，并以其为主要成份制备一种可预防和治疗多种EGFRvIII阳性肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤的药品。本专利技术还提供了一种细胞注射液。本专利技术所述的细胞注射液包括本专利技术所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞。...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于：所述CAR为一段融合多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述CAR包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域；所述抗原识别结构域包括针对表皮生长因子受体3号突变体(EGFRvIII)的单克隆抗体或其可变区或其抗原的结合区域。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于：所述CAR为一段融合多肽，其氨
基酸序列为SEQIDNO:1；所述CAR包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞
内T细胞信号传导结构域；所述抗原识别结构域包括针对表皮生长因子受体3
号突变体(EGFRvIII)的单克隆抗体或其可变区或其抗原的结合区域。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述抗原识别
结构域包括：IgGκ信号肽、以连接肽连接重、轻链形成的单链抗体片段(scFv)；
所述抗原识别结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:2；所述IgGκ信号肽的氨基酸
序列为SEQIDNO:3；所述单链抗体片段(scFv)的氨基酸序列为SEQIDNO:4。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述跨膜结构
域包括：铰链结构以及跨膜区；所述跨膜结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:5；
所述铰链结构的氨基酸序列为SEQIDNO:6；所述跨膜区的氨基酸序列为SEQ
IDNO:7。
4.根据权利要求1所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞，其特征在
于：所述细胞内T细胞信号传导结构域包含CD137和CD247；所述细胞内T细胞信
号传导结构域的氨基酸序列为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟慧霖，邹清雁，赖良学，唐时幸，刘海霞，
申请(专利权)人：广州熙帝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44