本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD138靶向性的NKT细胞及其应用，所述嵌合抗原受体为CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD138ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。采用本发明专利技术的嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞治疗进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤时，对骨髓瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤患者有一定的治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD138靶向性的NKT细胞(CAR138-NKT细胞)及其应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥ADCC(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)作用。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。另外，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。而且，研究表明，NKT细胞不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma，MM)是浆细胞异常增生的B细胞恶性肿瘤，以骨髓中积聚大量的恶性浆细胞并分泌单克隆免疫球蛋白为特征。骨髓瘤细胞表面表达一系列的粘附分子如CD138。CD138是一种属于跨膜粘蛋白聚糖家族成员，与骨髓微环境中的生长因子和基质成分相结合，介导多发性骨髓瘤细胞的粘附和归巢。随着对CD138研究的逐步深入，人们发现CD138在机体的损伤修复及肿瘤的生长、迁移中都起了关键作用。目前CD138被认为是浆细胞最特异的表面标志物，研究显示，CD138分子在B细胞恶性肿瘤中的表达非常复杂，在MM患者骨髓和外周血中的浆细胞表达，而骨髓中的造血前体细胞或淋巴细胞不表达。CD138分子水平的升高可以作为骨髓瘤预后不良的独立指标，并且当MM细胞呈现凋亡时，膜表面CD138分子表达下调或丢失，可反映MM患者体内肿瘤细胞的负荷。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD138靶向性的NKT细胞(CAR138-NKT细胞)及其应用，嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞在治疗进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤时，对骨髓瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤患者有一定的治疗效果。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，本专利技术的嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR138-NKT细胞在体外有高效的杀瘤活性，同时采用CAR138-NKT细胞治疗进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤时，对骨髓瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤患者有一定的治疗效果。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD138ScFv、CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。第二方面，本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。第三方面，本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了一种工程化CD138靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。第五方面，本专利技术提供了上述工程化CD138靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。在治疗进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤时，本专利技术的嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR138-NKT细胞，即工程化CD138靶向性的NKT细胞，在体外具有高效的杀瘤活性，在体内能够不依赖于白介素2而持续长久的存在，且能够特异性结合CD138抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别骨髓瘤细胞CD138抗原的能力，加强对骨髓瘤细胞的特异杀伤活性，而且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤患者，本专利技术的CAR138-NKT细胞具有较低的毒副作用，患者具有较好的耐受性，并且发挥一定的治疗效果。本专利技术的工程化CD138靶向性的NKT细胞为治疗进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。图2为本专利技术的慢病毒表达载体pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图3为本专利技术的慢病毒表达载体pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图4为本专利技术的慢病毒表达载体pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CAR138-NKT细胞)表型鉴定的结果。图7为本专利技术的CAR138-NKT细胞对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图。图8为本专利技术的CAR138-NKT细胞对进展期CD138阳性的多发性骨髓瘤患者的治疗过程中，患者外周血中骨髓瘤细胞数目的变化曲线本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD138ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，由CD138ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
【技术特征摘要】
2014.08.26 CN 20141042467441.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为
CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由CD138ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、
CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体
的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ
IDNO.2所示。
5.含有权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩为东，韩庆旺，王晓慧，陈美霞，王瑶，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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