抗cMet和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用技术

本发明专利技术提供了一种特异性双靶向抗体及其方法和应用。所述特异性双靶向抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与cMet抗原结合的第二抗原结合结构域，能特异地识别并结合cMet抗原过表达的肿瘤细胞，包括肝癌及其它cMet阳性的肿瘤疾病等，同时也能结合T细胞受体；并介导T细胞发挥杀伤作用，从而清除cMet感染，在诊疗、预防、检测cMet相关疾病中具有很大的应用价值。本发明专利技术还提供了一种具有编码所述特异性双靶向抗体的核苷酸序列的微环DNA。本发明专利技术提供了的特异性双靶向抗体以及微环DNA可用于制备抗体药物组合物或cMet阳性肿瘤细胞诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
抗cMet和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用
本专利技术涉及生物医药和诊疗领域，具体涉及一种抗cMet和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用。
技术介绍
cMet,也叫MET或肝细胞生长因子受体(hepatocytegrowthfactorreceptor，HGFR)，是由MET原癌基因编码的异二聚体蛋白，由A、B两个基组成。是肝细胞生长因子HGF的特异性膜表面受体，表达于多种组织细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞，介导HGF所有的生物学作用。cMet受到刺激后调节上皮细胞内的磷酸化程度,导致细胞发生改变,如促进有丝分裂,促进细胞运动、管状结构的生成有关。在人类机体正常情况下，只有干细胞和祖细胞表达cMet,参与胚胎胚胎期新的组织产生，在成年人时参与受损组织的再生。然而，肿瘤干细胞及低分化的肿瘤细胞，也过表达cMet，从而导致肿瘤的持久性和在体内扩散到其它部位。肿瘤组织的cMet激活与预后不良相关,cMet异常激活触发肿瘤生长异常活跃,形成新的血管,为肿瘤提供营养,并且促进肿瘤转移。这种cMet调节失控发生在许多类型的人类恶性肿瘤中,包括肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等。近年来，在肿瘤免疫治疗领域，出现了利用双靶向抗体(Bispecificantibody,BsAb)介导T细胞杀灭癌细胞的新疗法。人体免疫系统中，细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)扮演着重要的角色，具有T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)，能特异性识别并结合表达目标抗原的细胞，并分泌穿孔素和颗粒酶杀灭靶细胞。肿瘤细胞由于缺少免疫粘附分子和共刺激分子等原因,使得机体免疫无法有效识别和活化，从而使得CTL无法清除癌细胞。BsAb能够同时与T细胞和肿瘤细胞特异性抗原结合，可在T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触(immunesynapse)，发挥T细胞受体(TCR)一样的功能，从而激活T细胞免疫机制，介导T细胞杀死靶细胞。目前报道了一种cMet抗体，能特异性识别并结合cMet阳性肿瘤细胞。(即emibetuzumab，Lilly公司研发，临床3期实验，专利来源US20120263723)，该cMet抗体只能结合cMET感染的细胞，不能结合T细胞，无法介导T细胞杀伤；只能通过ADCC(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)或CDC(complement-dependentcytotoxicity)能靶向并杀灭cMet抗原阳性肿瘤细胞，但疗效不定，尚无论文发表。此外，目前报道的第一个上市的BsAb抗体：卡妥索单抗(Catumaxomab)，一种抗CD3和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的小鼠双特异性抗体，于2009年在欧盟获得批准用于治疗EpCAM阳性肿瘤的恶性腹水患者，取得了良好的效果。目前有18种双特异性抗体处于临床研究阶段，尚无双特异性抗体通过美国FDA审批上市，这18种双特异性抗体种也无针对cMet抗原的BsAb。2014年9月22日安进公司向美国FDA提交了急性淋巴细胞白血病治疗药物Blinatumomab的新药上市申请。Blinatumomab为CD19、CD3双特异性抗体，目前正在开展III期临床试验，如果能顺利通过审批Blinatumomab将成为第一个通过美国FDA审批上市的双特异性抗体。本专利技术旨在提供一个高效、低成本、抗cMet和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用。
技术实现思路
第一方面，本专利技术提供了一种特异性双靶向抗体，所述特异性双靶向抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与cMet抗原结合的第二抗原结合结构域。本专利技术提供了的特异性双靶向抗体(Bispecificantibody,BsAb)，能够同时与CD3和cMet抗原结合；特异地识别并结合cMet抗原阳性细胞，同时也结合表达CD3的T细胞，可在T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触(immunesynapse)，发挥T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)一样的功能，从而激活T细胞免疫机制，介导T细胞发挥杀伤cMet阳性肿瘤细胞的作用，从而清除cMet阳性肿瘤细胞。本专利技术所述的“双靶向”表示“能够同时与CD3和cMet抗原结合”。在本专利技术一个实施例中，本专利技术提供了的特异性双靶向抗体，可与CD3和cMet结合；该特异性双靶向抗体在文中亦称为“抗-CD3/抗-cMet特异性双靶向抗体”。“抗-CD3/抗-cMet特异性双靶向抗体”的抗-cMet部分可用于靶向表达cMet的细胞，如SMMC-7721肝癌细胞系，而特异性双靶向抗体分子的抗-CD3部分可用于活化T细胞。通过与cMet阳性细胞上的cMET和T细胞上的CD3的同时结合，促进活化的T细胞定向杀死(细胞裂解)被靶向的cMet阳性细胞。本专利技术的抗-CD3/抗-cMet特异性双靶向抗体，特别地，用于诊断、治疗cMet阳性肿瘤细胞，以及治疗、预防和/或控制与cMet的异常表达和/或由cMet的异常表达引发的生理紊乱的方法和组合物。这样的紊乱包括但不限于:癌症、非癌过度增生性细胞紊乱。本专利技术的示例性特异性双靶向抗体列于文中的表1和表2。本专利技术提供的特异性双靶向抗体中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域均包括的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR))。表1表2列出了本专利技术提供的特异性双靶向抗体的HCVR、LCVR的氨基酸序列，及其在序列表中的序列号。表2列出了编码本专利技术所述的HCVR、LCVR氨基酸序列对应的核苷酸序列，及其在序列表中的序列号。本专利技术提供的特异性双靶向抗体的氨基酸序列包括：至少一条第一抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列；具体HCVR和LCVR优选为任一选自表1的氨基酸序列。编码本专利技术提供的特异性双靶向抗体的核苷酸序列包括：至少一条第一抗原结合结构域的HCVR核苷酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR核苷酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR核苷酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR核苷酸序列；具体HCVR和LCVR优选为任一选自表2的核苷酸序列。表1序列表中的氨基酸序列在本专利技术一实施例中，3条不同序列的抗-CD3/抗-cMet特异性双靶向抗体，在表1中编号分别为BsAb-1、BsAb-2、BsAb-3，其中BsAb-1是经过筛选出的最佳效果的特异性双靶向抗体。在本专利技术一些实施例中，表1各序列具体为：SEQUENCENO.1中，CD3.HCVRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS；SEQUENCENO.2中，CD3.LCVRDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性双靶向抗体，其特征在于，所述特异性双靶向抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与cMet抗原结合的第二抗原结合结构域。

【技术特征摘要】
1.一种特异性双靶向抗体，其特征在于，所述特异性双靶向抗体具有特异性与人类CD3结合的第一抗原结合结构域和特异性与cMet抗原结合的第二抗原结合结构域。2.如权利要求1所述的特异性双靶向抗体，其特征在于，所述特异性双靶向抗体包括至少一条第一抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、至少一条第一抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列、至少一条第二抗原结合结构域的HCVR氨基酸序列、以及至少一条第二抗原结合结构域的LCVR氨基酸序列；其中，所述HCVR和LCVR分别为在表1中任选的HCVR和LCVR氨基酸序列。3.一种特异性双靶向抗体按下述一种或多种方法进行应用：(1)将所述特异性双靶向抗体单独进行应用；(2)将所述特异性双靶向抗体与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；(3)采用体内投递的方式将所述特异性双靶向抗体直接投递到患者体内进行治疗；(4)先通过体外转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘运洪，陈志英，何成宜，钟育健，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44