化学锁定的双特异性抗体制造技术

公开了一种用于以高特异性和高均一性形成化学锁定的双特异性或异二聚体抗体(优选IgG类)的方法。更具体地，公开了具有通过生物正交点击化学连接在一起的连接区的化学锁定双特异性IgG类抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】化学锁定的双特异性抗体
本公开提供了用于以高特异性和高均一性形成化学锁定的双特异性或异源二聚体抗体(优选IgG类)的方法。更具体地，本公开提供了具有利用生物正交点击化学(bio-orthogonalclickchemistry)连接的连接区的化学锁定的双特异性IgG类抗体。相关申请的交叉引用本专利申请要求2014年5月10日提交的61/991,508号美国临时专利申请的优先权。
技术介绍
人免疫球蛋白G或IgG抗体以四个亚类存在，每个亚类具有不同的结构和功能特性。IgG由两个重链-轻链对(半抗体)组成，该重链-轻链对通过直接连接铰链区中的Cys残基(EU索引编号：半胱氨酸残基226和229；Kabat编号：半胱氨酸残基239和242)的重链间二硫键连接。人IgG4分子以各种分子形式存在，其通过重链间二硫键的存在或不存在而不同。已经开发了多种多样的重组抗体形式，例如通过融合IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(Coloman等，NatureBiotech15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison，NatureBiotech25(2007)1233-1234)。另一种形式具有不再保留的抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如双体抗体、三体抗体或四体抗体、微抗体、几种单链形式(scFv、Bis-scFv)。但是这类形式能够结合两个或更多的抗原(Holliger等，NatureBiotech23(2005)1126-1136；Fischer和Leger，Pathobiology74(2007)3-14；Shen等，J.ImmunologicalMethods318(2007)65-74；和Wu等，NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。US2005/0163782中报道了用于从包含其中通过至少一个链间二硫键连接的二聚体和其中未通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的该两种类型混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与未通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。双特异性抗体是难以使用传统的杂种杂交瘤和化学偶联方法以足够数量和质量产生的材料。此外，WO2005/062916和美国专利申请2010/0105874描述了如何通过还原抗体“AA”和抗体“BB”以将二硫键分离成具有单一结合区域的单重链-轻链单元(A或B)(其中A和B两者结合不同的靶标)来形成双特异性抗体。然后，抗体允许二硫键发生异构化，以使得抗体AB、BA、AA和BB各自以约25％的概率重组。然而，AB和BA两者是相同的双特异性抗体，且因此最多表现出约50％的产率。因此，这需要额外的步骤来将形成的所需的双特异性抗体从原始的重组抗体分离。然而，美国专利申请2010/0105874指向具有CPSC序列的IgG4中的铰链区，并且陈述：“CPSC序列导致更灵活的核心铰链和形成链内二硫键的可能性….据信具有IgG4样核心铰链序列的抗体可以具有用于重排二硫键的内在活性，其通过本专利技术方法中使用的条件模拟”(第0013段)。此外，已经制备了其他形式的双特异性抗体，其具有通过改变抗体A和B的重链序列产生的“杵和臼”结构。因此，本公开提供了产生化学锁定的双特异性IgG抗体的方法，其满足本领域对双特异性抗体的很高产率的需要并且比改变固定的抗体区域中的氨基酸序列的杵和臼方法具有更好的稳定性。
技术实现思路
本公开提供了用于从IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其Fab2片段“A”和IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其Fab2片段“B”产生化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”的方法。该方法包括：(a)在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下使所述第一抗体“A”与还原剂接触，以产生一对第一抗体片段A'，每个第一抗体片段A'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(b)将第一异双官能接头连接到所述第一抗体片段A'，其中所述第一异双官能接头包含(i)用于与所述第一抗体片段A'的所述重链的反应性巯基共价连接的第一巯基反应性官能团，和(ii)叠氮化物，从而形成叠氮化物官能化的第一抗体片段；(c)在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下使所述第二抗体“B”与还原剂接触，以产生一对第二抗体片段B'，每个第二抗体片段B'包含连接于单一重链的单一轻链，所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(d)将第二异双官能接头连接到所述第二抗体片段B'，所述第二异双官能接头包含：(i)用于与所述第二抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第二巯基反应性官能团，和(ii)炔；从而形成炔官能化的第二抗体片段；(e)使所述叠氮化物官能化的第一抗体片段与所述炔官能化的第二抗体片段反应以通过所述叠氮化物与所述炔的1,3-偶极环加成将所述第一抗体片段共价连接于所述第二抗体片段，从而形成化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”。还原铰链区中二硫键的步骤优选在基本上不还原重链和轻链之间的二硫键的条件下进行，这意味着，在一些实施方式中，至少约90％或至少约95％或至少约99％的这类重链和轻链之间的二硫键在铰链区中的二硫键裂解后保持完整。优选地，第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是巯基反应性官能团，L是烃接头，且N3是叠氮化物。优选地，该巯基反应性官能团Q是卤代烷(例如，烷基氯、烷基溴或烷基碘)、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺(溴代马来酰亚胺)或二卤代马来酰亚胺(二溴代马来酰亚胺)。优选地，L是在Q和N3之间直链中具有3-60个原子(例如，更典型地为6-50个)的烃接头。更优选地，L是聚环氧烷(PEF)基团或L是其中每个链节(mer)单元是–(CH2CH2–O)n或(O–CH2CH2)n–的聚合物(其中“n”独立地是1-20的整数，更通常为1-8)。优选地，第一异双功能性接头(连接到第一抗体片段)是：其中Q可以是适合于将接头连接到抗体片段上的任何基团，但优选能够与来自重链铰链区中的半胱氨酸残基的巯基共价键合。示例性基团Q是：其中Z独立地选自H、Br、I和SPh。优选地，至少一个Z不是H，尽管在马来酰亚胺的情况下，Z在每次出现时可以是氢。M独立地为CR*或N。X1、X2、X3、X2、X4和X5独立地选自键(即不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–(C＝O)–(CH2)n–、(C＝O)–O–(CH2)n–、(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”为0或1-10的整数。Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其包括：(a)使所述第一抗体A与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第一抗体片段A'，每个第一抗体片段A'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(b)将第一异双官能接头连接到所述第一抗体片段A'，所述第一异双官能接头包含(i)用于与所述第一抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第一巯基反应性官能团和(ii)叠氮化物，从而形成叠氮化物官能化的第一抗体片段；(c)使所述第二抗体B与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第二抗体片段B'，每个第二抗体片段B'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(d)将第二异双官能接头连接到所述第二抗体片段B'，所述第二异双官能接头包含(i)用于与所述第二抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第二巯基反应性官能团和(ii)炔；从而形成炔官能化的第二抗体片段；和(e)使所述叠氮化物官能化的第一抗体片段与所述炔官能化的第二抗体片段反应，以通过所述叠氮化物对所述炔的环加成将所述第一抗体片段共价连接于所述第二抗体片段，从而形成化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.10 US 61/991,5081.一种用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其包括：(a)使所述第一抗体A与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第一抗体片段A'，每个第一抗体片段A'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(b)将第一异双官能接头连接到所述第一抗体片段A'，所述第一异双官能接头包含(i)用于与所述第一抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第一巯基反应性官能团和(ii)叠氮化物，从而形成叠氮化物官能化的第一抗体片段；(c)使所述第二抗体B与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第二抗体片段B'，每个第二抗体片段B'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；(d)将第二异双官能接头连接到所述第二抗体片段B'，所述第二异双官能接头包含(i)用于与所述第二抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第二巯基反应性官能团和(ii)炔；从而形成炔官能化的第二抗体片段；和(e)使所述叠氮化物官能化的第一抗体片段与所述炔官能化的第二抗体片段反应，以通过所述叠氮化物对所述炔的环加成将所述第一抗体片段共价连接于所述第二抗体片段，从而形成化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”。2.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是包含烷基卤、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺的巯基反应性官能团；且L是具有3-60个原子的烃接头，和N3是叠氮基。3.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是包含马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺基团的巯基反应性官能团；和L是在具有单元-(CH2CH2-O)n-和/或-(O-CH2CH2)n-的聚合物构型中具有3-60个原子的烃接头，其中“n”独立地是1-20的整数；和N3是叠氮基。4.根据权利要求2所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双功能接头具有以下形式：其中Q是以下形式的巯基反应性基团：其中Z独立地选自H、Br、I和SPh，条件是至少一个Z不是H；和M独立地是CR*或N；其中X1、X2、X3、X2、X4和X5独立地选自键、-O-、-NRN-、-N＝C-、-C＝N-、-N＝N-、-CR*＝CR*-(顺式或反式)、-C≡C-、-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NRN-、-(C＝O)-(CH2)n-、-(C＝O)-O-(CH2)n-、-(C＝O)-NRN-(CH2)n-和-(C＝O)-NRN-(CH2CH2-O)n-，其中“n”为0或1-10的整数；其中Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元的环状烃、杂环、芳基或杂芳基环；其中“n”独立地为0或1-10的整数；和其中“l”、“p”、“q”和“r”独立地为0或1-10的整数；Ω是键或者是C3-26烃环或稠环系统，任选地包含至多四个稠合环，其中每个环具有3-8元和任选地在每个环中包含1-4个选自O、S和N的杂原子；其中R*和RN独立地为H或C1-12烃，任选被1-6个选自卤素、O、S和N的杂原子取代；和其中R*和/或RN可以一起形成3-8元环。5.根据权利要求4所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中Q是马来酰亚胺、溴代-马来酰亚胺或二溴代马来酰亚胺。6.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双官能接头具有Q-L-G的形式，其中Q是包含烷基卤、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺的巯基反应性官能团；且L是具有3-60个原子的烃接头，和G是含炔基团。7.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G是-C≡CH。8.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G包含具有-C≡C-键的C8环。9.根据权利要求8所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G具有以下形式：10.根据权利要求8所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G具有以下形式：11.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双官能接头具有Q-L-G的形式，其中Q是包含马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺基团的巯基反应性官能团；L是具有3-60个原子和包含具有单元–(CH2CH2–O)n–或–(O–CH2CH2)n–的聚合物的烃接头，其中“n”独立地是1-20的整数；且G是C8-20烃，其包含具有能够与叠氮化物发生1,3偶极环加成反应的-C≡C-键的C8环。12.根根据权利要求10所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双功能接头具有以下形式：其中，Q是以下形式的巯基反应基团：其中Z独立地选自H、Br、I和SPh，条件是至少一个Z不是H；和M独立地是CR*或N；G是C8-20烃基团，其包含具有能够与所述的叠氮化物发生1,3偶极环加成反应的-C≡C-键的C8环；X1、X2、X3、X2、X...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·福，G·F·考夫曼，B·琼斯，R·图赫里，
申请(专利权)人：索伦托治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US