双特异性偶联抗体及其制法和用途制造技术

本发明专利技术提供了双特异性偶联抗体及其制法和用途。具体地，本发明专利技术提供了抗CTLA-4的人源单链抗体(scFv)，该抗CTLA-4抗体，具有亲和力高、特异性强的优点。在此基础上，本发明专利技术人意外地发现，使用抗CTLA-4抗体构建重组双特异性偶联抗体(人源化抗Her-2全抗体(Trastuzumab)与抗CTLA-4的人源单链抗体(scFv，single-chainantibodyfragment)融合)，能够显著增强机体的免疫反应，能够保持或增强T细胞的激活状态。

Bispecific antibody conjugate and its preparation method and Application

The present invention provides bispecific antibody conjugate and its preparation method and application. In particular, the present invention provides a humanized single chain antibody (scFv) against CTLA-4, which has the advantages of high affinity and strong specificity of the CTLA-4 antibody. On this basis, the inventor accidentally found that the recombinant bispecific antibody conjugated with anti CTLA-4 antibodies (humanized anti Her-2 antibody (Trastuzumab) and human scFv antibody against CTLA-4 (scFv, single-chainantibodyfragment) fusion), can significantly enhance the immune response, to maintain or enhance the activation of T cells.

【技术实现步骤摘要】
双特异性偶联抗体及其制法和用途
本专利技术属于是生物医药领域，具体地为双靶点单克隆抗体抗肿瘤免疫治疗领域。
技术介绍
Her-2是由致癌基因HER-2编码的表皮生长因子受体跨膜蛋白，受体蛋白的胞内段具有酪氨酸激酶活性。在Her-2形成同源二聚体或与其家簇其它受体成员形成异源二聚体时，胞内段的酪氨酸激酶被激活，然后激活多条胞内信号通道。其中最主要的信号通道具有刺激细胞生长和分裂，以及抗自身凋亡和维持细胞生存的功能(1,2)。在近三分之一的乳腺癌患者的癌细胞里发现HER-2基因被大量复制或突变，使Her-2蛋白过量表达或持续激活，造成细胞癌变。以Her-2为靶点，具有抑制Her-2活性的曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab)被开发出来，是第一个被批准用于治疗Her-2阳性乳腺癌患者的人源化单克隆抗体。11-26％的恶性乳腺癌患者对单一曲妥珠单抗药物治疗有疗效，如果和化疗联合使用，早期和晚期的乳腺癌患者的治愈率和生存率都会显著的提高。虽然有如此好的疗效，但仍有相当一部分Her-2阳性的病人对曲妥珠单克没有反应，而且那些早期治疗有反应的病人，其中大部分会在后期治疗时产生对曲妥珠单抗治疗的抗性(3,4)。曲妥珠单抗抑制肿瘤的活性，不仅取决于抑制Her-2的活性，还取决于曲妥珠单抗诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)(5,6)。不能结合IgGFc受体(FcR)的抗Her-2抗体被证明没有抗肿瘤效果(7)，在FcR基因缺失的小鼠里，曲妥珠单抗被证明也没有疗效(8)，另外，在曲妥珠单抗治疗的病人乳腺肿瘤切片里发现FcR阳性免疫细胞增加，主要是自然杀伤细胞(NK)(9)。这些数据说明了先天免疫系统ADCC的活性是曲妥珠单抗抑制肿瘤机制之一。不仅如此，获得性免疫在曲妥珠单抗抑制肿瘤效果中也起作很重要的作用。在具有免疫活性的小鼠Her-2阳性乳腺肿瘤模型里，为了达到更好的抗肿瘤效果，抗Her-2抗体需要CD8α+细胞，MyoD88信号通道和RAG依赖的获得性免疫活性(8)。进一步的研究证明，传统的淋巴细胞介导的细胞间素毒性I型干扰素(INF-I)和gamma干扰素(INFγ)对曲妥珠单抗抑制肿瘤的效果很重要，其中CD8α+T细胞产生的INFγ起着关键的作用(10)。重组INFγ能直接抑制Her-2阳性肿瘤细胞的体外生长，而且能显著增强抗Her-2抗体抑制细胞生长的能力。另外，INFγ显著增加I型MHC在肿瘤细胞表面的表达。综合这些数据，解释了INFγ在曲妥珠单抗抑制肿瘤效果中的重要性。既然获得性免疫活性在曲妥珠单抗抑制肿瘤效果中有如此的重要性，增强免疫细胞的激活或者维持免疫细胞的激活，都会加强曲妥珠单抗抑制肿瘤的效果。事实上，有研究发现，曲妥珠单抗与抗CD137单抗联合使用，会加强淋巴细胞的存活，特别是CD8+T细胞的存活能力(10)。CD137抗体还能增强NK细胞和DC细胞的激活和功能，通过FcR+细胞和获得性免疫细胞加强抗Her-2抗体的抗肿瘤效果(11)。另外，利用细胞程序死亡-1(PD-1)抗体阻断PD-1通道，能显著增加曲妥珠单抗诱导的获得性免疫T细胞抗肿瘤活性(10)。T细胞的激活不仅需要抗原呈现细胞(APCs)上的MHC-多肽复合物对T细胞受体的刺激，还需要共刺激信号和抑制信号之间的平衡。多个机制相互作用共同调解CD4+和CD8+T淋巴细胞的激活，包括扩增或抑制T细胞反应的细胞表面蛋白(12)。T细胞表面上的负调节蛋白，比如CTLA-4，PD-1，B7家族分子B7-H4，T细胞免疫分子和淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)，和在不同类型细胞上它们的配体结合，导致T细胞生长和功能活性的下降(12，13)。为了有效的控制激活的免疫细胞和产生有效的免疫反应，机体有必要对这些免疫检查点负调节蛋白的表达进行严格的调控。在癌症和一些病毒感染中常见的慢性抗原暴露会使抗原特异性T淋巴细胞持续表达CTLA-4，PD-1和LAG-3这类分子，导致邻近细胞产生对抗原耐受性(14)。因此，以免疫检查点负调节蛋白为靶点的药物开发正在受到极大的关注。CD28分子是持续表达的属于免疫球蛋白家族的一个蛋白，它介导T细胞共刺激信号。CD28结合APC上的陪体B7-1和B7-2，诱导白介素-2(IL-2)和抗细胞凋亡因子的产生，从而刺激T细胞的生长(15)。T细胞被激活后，在细胞表面产生CTLA-4，它和CD28分子非常类似(16)，可以结合B7-1和B7-2，而且结合的力度和亲和力更大(特别是和B7-1的结合)。因此，很微量的CTLA-4分子就能有效的和CD28竞争结合其陪体，降低T细胞反应(17)。另外，CTLA-4还有其内在和外在的作用机理，包括从免疫突触体清除PKC-beta和CARMA1的区域化，限制T细胞的存在时间和增强T调节细胞(Tregs)功能。总的来说，这些机制抑制细胞生长进程，抑制IL-2的产生和细胞生存途径，最终导致免疫反应终止(18)。CTLA-4基因敲除小鼠实验很好地证明了CTLA-4作为负调节分子的重要性。CTLA-4缺陷型小鼠在淋巴结，脾脏和几个外周器官表现CD28依赖的大规模自身反应性T细胞扩张。这些小鼠由于扩散性的淋巴生长导致的疾病，在出生不到4周后死亡(19)。CTLA-4作为T细胞反应的一个主要免疫检查点分子，它对获得性免疫反应的记忆形成也有影响。最近研究发现，阻断CTLA-4可以减少专业多功能的CD4+T记忆细胞数，进而调节总体记忆细胞池的质量(20)。另外一个体内的研究发现，注射CTLA-4抗体可以增加CD8+T记忆细胞扩增，然后积累能产生INFg和TNFa的免疫细胞数(21)。利用不同的CTLA-4单克隆抗体研究已经证明，选择性的阻断CTLA-4能增强内部的或诱导的抗肿瘤免疫反应，这为在临床上以CTLA-4为靶点的单克隆抗体开发提供了支持。2个完全人源抗体，Ipilimumab和Tremelimumab，都可结合CTLA-4并阻断其与B7陪体的结合，进而增强T细胞的激活和增殖(22，23)。Ipilimumab和Tremelimumab在过去的10年里，进行了大量的针对黑色素瘤治疗的临床研究，并在2011年，Ipilimumab被美国，欧盟和澳大利亚药监局批准用于治疗不能手术切除或转移性的黑色素瘤(24)。CTLA-4阻断提供了一个新的免疫系统调节模式，它代表了肿瘤治疗领域中一个里程碑式的发现。目前，CTLA-4单克隆抗体治疗正在多个类型肿瘤的临床试验中进行，包括黑色素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，以及前列腺癌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双特异性偶联抗体及其制法和用途。本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO:5所示的CDR1，SEQIDNO:6所示的CDR2，和SEQIDNO:7所示的CDR3。在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。本专利技术的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本专利技术第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中，D1特异性结合靶分子Her‑2蛋白；D2特异性结合靶分子CTLA‑4蛋白；所述D1为特异性结合Her‑2蛋白的抗体或抗体片段；和/或所述D2为特异性结合CTLA‑4蛋白的抗体或抗体片段；其中，所述D1具有SEQ ID NO.:4所述的重量可变区，和SEQ ID NO.:10所述的轻链可变区。

【技术特征摘要】
1.一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中，D1特异性结合靶分子Her-2蛋白；D2特异性结合靶分子CTLA-4蛋白；所述D1为特异性结合Her-2蛋白的抗体或抗体片段；和/或所述D2为特异性结合CTLA-4蛋白的抗体或抗体片段；其中，所述D1具有SEQIDNO.:4所述的重量可变区，和SEQIDNO.:10所述的轻链可变区。2.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO:5所示的CDR1，SEQIDNO:6所示的CDR2，和SEQIDNO:7所示的CDR3；优选地，所述重链可变区具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。3.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求2所述的重链可变区和重链恒定区。4.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：SEQIDNO:11所示的CDR1’，SEQIDNO:12所示的CDR2’，和SEQIDNO:13所示的CDR3’；优选地，所述的轻链可变区具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。5.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求4所述的轻链可变区和轻链恒定区。6.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：(1)如权利要求2所述的重链可变区；和/或(2)如权利要求4所述的轻链可变区；优选地，所述抗体具有：如权利要求3所述的重链；和/或如权利要求5所述的轻链。7.一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如权利要求2所述的重链可变区的序列、如权利要求3所述的重链的序列、如权利要求4所述的轻链可变区的序列、如权利要求5所述的轻链的序列、或如权利要求6所述的抗体的序列；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。8.一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中，D1特异性结合靶分子Her-2蛋白；D2特异性结合靶分子CTLA-4蛋白；优选地，所述D1为特异性结合Her-2蛋白的抗体或抗体片段；和/或所述D2为特异性结合CTLA-4蛋白的抗体或抗体片段。9.一种多核苷酸，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡则玲，陈羿，
申请(专利权)人：上海康岱生物医药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31