双特异性抗体制造技术

本申请提供双特异性抗体，其由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞具有特异性，该单价单元针对肿瘤细胞或微生物具有特异性。该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(scFv)且该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途和诊断用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性抗体
技术介绍
双特异性抗体（BsAb)为具有两种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。BsAb广 泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。目前，对于免疫治疗研究的一个关注焦 点为如何利用BsAb的细胞介导的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。BsAb可设计为同时靶向作用 于肿瘤细胞和效应细胞，同时激发效应细胞使其杀灭肿瘤细胞。 BsAb可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势 在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的双特异性抗体片段，包括 双体，串联的（tanderm)ScFv和单链双体及其衍生物（参见Jin和Zhu,于the design and engineering of IgG-Like bispecific antibodies，', RE Kontermann (编），Bispecific antibodies)。由于这些BsAb不具有IgG Fe结构域，因此它们的小的尺寸使得它们渗透进 入肿瘤的能力增强，但它们在体内具有相当短的半衰期并且缺乏ADCC作用，该作用与抗体 的恒定区相关联。 为了增强稳定性和治疗能力，对重链进行重组基因改造以促进它们的异二聚化并 获得较高的含Fc的IgG类双特异性抗体的产量。已经有几种合理的设计方案用于改造抗体 CH3链用于异二聚化，即，二硫键、盐桥、件-臼（knobs-into-holes)。在并置的位置处产生 件（knob)和臼（hole)的基础在于该件和臼相互作用将有助于形成异二聚体，然而件-件 和臼-臼相互作用因有利的相互作用缺失而不利于形成同二聚体。尽管该杵-臼方案解 决了重链同二聚化问题，但这没有解决来自两种不同抗体的轻链和重链之间的错配问题。 虽然有可能对于两种不同抗体识别相同的轻链，但使用具有相同轻链的两种抗体序列构建 BsAb的可能性非常小。 因此需要提供更好的易于制备的BsAb，并且该BsAb具有较好的临床稳定性和效 力和/或减弱的系统毒性。
技术实现思路
抟术问是页 本申请的一个实施例提供了一种抗体，该抗体包含：(a)轻链-重链对，该轻链-重 链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和（b)融合肽，该融合肽包含单链可变片段（scFv) 和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。 抟术解决方案 在某些方面，该轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异性。一方面，该肿瘤抗原选 自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、 CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素（Integrin)、ανβ3、 α 5 β 1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、ΕΡΗΑ3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌膜蛋白 (Tenascin)。一方面，该轻链-重链对针对较对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达 的蛋白具有特异性。 在某些方面，该轻链-重链对针对病毒或细菌具有特异性。一方面，该轻链-重链 对针对内毒素具有特异性。 在某些方面，该免疫细胞选自T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、 树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。 在某些方面，该融合肽针对以下抗原具有特异性，该抗原选自⑶3、⑶16、⑶19、 CD28 和 CD64。 在某些方面，该轻链通过二硫键与该重链结合。在某些方面，该重链通过一个或多 个二硫键与该融合肽结合。一方面，该重链包含人或者人源化的（humanized)Fc片段。一 方面，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人或者人源 化的Fc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。 在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处 或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成离子键。一方面，这些替换选自表1。 在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处 或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成杵-白结构配对。一方面，这些替换选自 表2。 在某些方面，该CH2结构域位于该SCFv片段和CH3结构域之间。一方面，该融合 肽不包含CHl结构域。 在一个实施例中，本申请还提供一种包含上述任一实施例中的抗体的组合物。一 方面，载体为药物载体。 另一实施例提供了一种复合体，该复合体包含与一个或多个抗原结合的上述任一 实施例中的抗体。 本申请进一步提供了一种抗体的制备方法，该方法包括：将（a)轻链-重链对和 (b)融合肽混合，该轻链-重链对针对免疫细胞具有特异性，且该融合肽包含单链可变片段 (scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽对于肿瘤细胞具有特异 性。一方面，本申请提供一种可通过该方法获得的抗体。 【附图说明】 图1显示了本申请的双特异性抗体的一个实施例的结构； 图2显示了图1双特异性抗体的每条链的表达载体的构造； 图3为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL2000指示物（marker);泳道1 :赫赛汀 (Here印tin) VH ;泳道2 :赫赛汀VL ;泳道3 :人IgGlCH区域（CH1+铰链+Fe);泳道4 :人 IgCL ； 图4为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL1000DNA指示物；泳道1 :人源化的 0KT3 (H0KT3) VH-接头；泳道 2 :接头-H0KT3VL ; 图5为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL10000DNA指示物；泳道I :H0KT3单链； 图6-8为用于定点诱变的质粒的限制图谱； 图9显示了 6%凝胶SDS-PAGE图和蛋白质印记（Western blot)图。样品为293F 细胞上清液。泳道M :蛋白指示物；泳道1 :赫赛汀mAb ;泳道2 :T366W修饰的H0KT3单链 +Y407A修饰的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道3 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3 单链+D356K D399K Y407A修饰（DDY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道4:K392D和K409D 修饰（KK)的H0KT3单链+D356K D399K修饰（DD)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道5 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3单链+L368R D399K Y407A修饰（LDY)的赫赛汀重链 +赫赛汀轻链；泳道6 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3单链+D399KY407A修饰 (DY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链； 图10显示了 6% SDS-PAGE凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色结果，该图显示：泳道 M :蛋白标记物；泳道1 :纯化的MSBODY ;泳道2 :赫赛汀；泳道3 :H0KT3单链； 图11显示了抗Her2X抗⑶3MSB0DY结合至BT474细胞（A)和外周血单核细胞 (PBMC) (B)的细胞表面结合的流式细胞分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，包含：(a)针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链‑重链对；和(b)融合肽，所述融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 一种抗体，包含： (a) 针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对；和 (b) 融合肽，所述融合肽包含单链可变片段（scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的 Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性。2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异 性。3. 根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：EGFR、Her2、EpCAM、 CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD 133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋 白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5βl、ERBB2、ERBB3、MET、IGFlR、EPHA3、 TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌腱蛋白。4. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对在肿瘤细胞上相对 于对应的非肿瘤细胞过表达的蛋白具有特异性。5. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对病毒或者细菌具有 特异性。6. 根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对内毒素具有特异 性。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其特征在于，所述免疫细胞选自T细胞、B 细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细 胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其特征在于，所述融合肽针对选自CD3、 ⑶16、⑶19、⑶28和⑶64的抗原具有特异性。9. 根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链通过二硫键与所述 重链结合。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链通过一个或多个二 硫键与所述融合肽结合。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链包含人或者人源 化的Fc...

【专利技术属性】
技术研发人员：周鹏飞，张敬，严永祥，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42