一种用于特异性识别细胞的印迹材料及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于特异性识别细胞的印迹材料及其制备和应用。所述的细胞印迹材料以细胞为模板，采用细胞培养与细胞固定技术将其固定于基质材料表面，通过在基质材料表面固化预聚合体系，然后分离除去基质材料，再去除固化后聚合物表面的模板细胞制备得到。该细胞印迹材料具有高选择性和高稳定性，并被进一步应用于细胞的识别、捕获与富集中。

Imprinted material for specific cell recognition, preparation and use thereof

The present invention relates to a blot material for specific recognition of cells and its preparation and use. Cell imprinting materials the cells as a template, using cell culture and cell fixation will be fixed to the surface of the materials, through the polymerization on the surface of pre curing the matrix material, and then removing the matrix material, and then remove the template after curing cells for polymer surface preparation. The imprinted material has high selectivity and stability, and is further applied to cell identification, capture and concentration.

【技术实现步骤摘要】
一种用于特异性识别细胞的印迹材料及其制备和应用
本专利技术属于功能性生物材料，及其制备技术及其在细胞识别、捕获、释放和富集中的应用，具体的说是一种新型的可以特异性识别细胞的印迹材料，及其制备和应用。
技术介绍
细胞的高通量和高灵敏度检测在肿瘤诊断与治疗、环境检测和生物传感器研究中具有十分重要的作用(AherneA.etal.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118,8771-8772)。目前，在细胞浓度较低的环境中，细胞的检测十分困难，其主要原因是细胞含量较少，无法得到。因此，实现低细胞浓度环境中细胞检测的前提是能够将目标从环境中识别和富集出来。细胞识别与富集细胞识别与富集技术是一种可以特异性识别和捕获目标细胞的技术。目前，识别与富集目标细胞的技术主要有两种类型，一种是基于免疫原理的技术。该技术一方面利用与目标细胞结合的抗体识别和富集细胞，另一方面利用与干扰细胞结合的抗体去除非目标细胞，达到间接识别和富集目标细胞的目的。另一种技术是基于目标细胞物理性质的技术，包括细胞的大小、密度、可变形性和带电性等。该技术利用目标细胞与干扰细胞在上述物理性质方面的差异达到识别和富集目标细胞的目的。然而，由于细胞表面抗原表达的不确定性，无法获得针对重要细胞的抗体，从而导致基于免疫原理的技术无法有效发挥其作用。另外，即使同一种细胞在不同条件下其物理性质也不尽相同，故而基于物理性质技术获得的细胞往往纯度和灵敏度较差(CatherineAlix-Panabièresetal,Nat.Rev.Cancer,2014,14,623-631).因此，开发一种既能够替代抗体，又能够特异性识别和富集细胞的材料就显得十分重要。分子印迹技术是一项以分子识别理论为基础，模拟抗体-抗原相互作用的方式，通过人工设计和合成具有特定结构和功能的分子识别材料的新技术。利用该技术制备的分子印迹材料实现对复杂环境中的目标分子的特异性识别和富集。其中，细胞印迹技术是一种以细胞为模板的新兴分子印迹技术，由其制备的细胞印迹材料作为一种天然抗体的替代品，不仅可以精确模拟天然抗体的特异性识别能力，而且具有环境耐受性更强，重复利用率更高以及适合规模化合成等优势(Schirhagl,R.etal,Anal.Chem.,2014,86,250-261)。因此，在细胞印迹技术的基础上，我们以细胞为模板，首先采用细胞培养与细胞固定技术将模板细胞固定于基质材料上，其次引发预聚合体系在基质材料表面的固化作用得到印迹层，然后分离基质材料与印迹层，最后去除印迹层表面的模板细胞。当模板细胞除去后，材料表面就会形成与模板细胞发生多重作用的印迹位点。从而获得了具有特异性识别和富集目标细胞能力的印迹材料，并实现了细胞的识别、捕获、释放和富集。
技术实现思路
以待特异性识别的细胞为模板，采用细胞培养与细胞固定技术将其固定于基质材料上，通过在基质材料表面固化聚合预聚合体系形成印迹层，分离印迹层与基质材料，然后去除印迹层表面的模板细胞，得到一种能够特异性识别模板细胞的印迹材料，并将该材料应用于细胞的识别、捕获、释放和富集过程中。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：(1)采用物理处理或化学修饰方法改造基质材料表面，使其利于细胞在其表面固定。其中，基质材料包括细胞培养瓶、细胞培养板、细胞培养皿、载玻片、盖玻片中的一种或二种以上，基质材料的基质为硅氧烷类基质、聚苯乙烯类基质和金属基质。基质材料表面的改性方法包括物理涂层、表面热处理、机械打磨和等离子体表面处理的一种或二种以上；以及将能与模板细胞发生相互作用的抗体、核酸适配体、多肽和蛋白质中的一种或二种以上固载在基质材料表面。(2)在不需处理或已处理的基质材料表面采用生长贴附、物理吸附、免疫作用等方式固定模板细胞。模板细胞是指动物细胞、植物细胞、真菌、细菌、和孢子。(3)随后将预聚合体系加入到固定有细胞的基质材料表面，以光引发、热引发或自由基引发等方式引发预聚合体系固化。其中，预聚合体系中的单体是丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、石墨烯掺杂丙烯酰胺、石墨烯掺杂N,N-二甲基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N,N-亚甲基双丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-异丙基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-羟甲基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-叔丁基丙烯酰胺、甲基氯硅烷、苯基氯硅烷、甲基乙烯基氯硅烷、乙基三氯硅烷、丙基三氯硅烷、乙烯基三氯硅烷、γ-氯丙基三氯硅烷和氟硅单体、聚二甲基硅氧烷，多巴胺、烯丙基胺、乙烯、丙烯、丁二烯、苯乙烯、4-乙烯基吡啶、衣康酸、丙烯酸、丙烯酸钠、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、对苯乙烯、乙二醇二甲基丙烯酸甲酯、氯苯乙烯、2-(三氟甲基)丙烯酸、丙烯腈、乙烯醇、乙酸乙烯、丙烯醛、聚氨基甲酸酯和2-羟基丙酸中的一种或二种以上；能通过自组装方式形成高分子材料的聚合物，包括聚砜、聚醚砜和聚芳砜中的一种或二种以上；用于溶解或分散单体或聚合物的溶剂包括水、磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、甲醇、乙醇、甲苯、乙醚、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、环己烷、苯、乙酸、苯甲醚、二甲基亚砜、溴苯、二氯化碳、四氯化碳、N,N-二甲基甲酰胺和三氟乙酸中的一种或二种以上；由功能单体或聚合物溶解或分散于溶剂中形成的溶液的质量浓度范围为5％-90％。(4)预聚合体系固化后，将基质材料与印迹层分离。接着用胰酶消化法或溶剂萃取法等将印迹层表面的模板细胞彻底去除，直至检测不到模板细胞的存在，进而得到识别和富集细胞的印迹材料(MIP)。(5)在基质材料上不固载模板细胞，按照上述从(1)到(4)的步骤制备得到非印迹材料(NIP)。(6)将该细胞印迹材料用于生物分析、生物化工、生物医学和生物
内细胞的选择性识别、捕获、释放和富集。本专利技术是一种基于模板细胞与印迹位点之间的多重作用的细胞印迹材料，该材料能对目标细胞进行特异性识别、捕获、释放和富集。当模板细胞与预聚合体系接触时会形成多重作用位置，通过在预聚合体系的固化过程中记忆二者之间的多重作用，当模板细胞除去后，材料表面就会形成与模板细胞发生多重作用的印迹位点。模板细胞与印迹位点之间在空间结构、大小、形状和官能团上，通过空间构型和氢键作用、静电作用以及范德华作用表现出的互补亲和能力。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术利用细胞印迹技术制备得到了能用于特异性识别细胞的印迹材料。利用印迹材料表面形成的与细胞发生多重作用的印迹位点，提高了细胞识别和富集的纯度与灵敏度，降低了富集细胞时非特异性作用的干扰。(2)本专利技术中的印迹材料对目标细胞的识别是多重作用，包括空间构型和氢键作用、静电作用以及范德华作用，对目标细胞表现更强出的互补亲和能力。(3)本专利技术中所用的基质材料和预聚合体系具有良好的生物兼容性和稳定性，利于保持细胞的活性与结构以及重复使用，进而有利于再识别目标细胞。(4)本专利技术中细胞印迹材料的制备流程简单，易于操作。相较于其他细胞识别与富集方法，采用该材料能简化识别过程，提高识别效率，应用范围更广。附图说明图1：SMMC-7721细胞在细胞培养板表面的贴附效果图；图2：印迹层表面的SMMC-7721细胞；图3：以SMMC-7721细胞为模板制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于特异性识别细胞的印迹材料，其特征在于：其可按如下过程制备获得，以待特异性识别的细胞为模板细胞，将模板细胞附着或固定于基质材料表面，再将其置于预聚合体系中，通过在基质材料表面固化预聚合体系，然后分离除去基质材料，再去除固化后聚合物表面的模板细胞，得到可用于模板细胞特异性识别的印迹材料。

【技术特征摘要】
1.一种用于特异性识别细胞的印迹材料，其特征在于：其可按如下过程制备获得，以待特异性识别的细胞为模板细胞，将模板细胞附着或固定于基质材料表面，再将其置于预聚合体系中，通过在基质材料表面固化预聚合体系，然后分离除去基质材料，再去除固化后聚合物表面的模板细胞，得到可用于模板细胞特异性识别的印迹材料。2.如权利要求1所述的模板细胞，其特征在于：模板细胞为生物学中构成生物体的基本单位，包括动物细胞、植物细胞、真菌、细菌和孢子中的一种或二种以上。3.如权利要求1所述的预聚合体系，其特征在于：预聚合体系由能引发聚合或自组装形成高分子材料的单体或聚合物组成的溶液。4.如权利要求3所述的由能引发聚合或自组装形成高分子材料的单体或聚合物组成的溶液，其特征在于：能发生聚合反应形成高分子材料的单体，包括丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、石墨烯掺杂丙烯酰胺、石墨烯掺杂N,N-二甲基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N,N-亚甲基双丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-异丙基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-羟甲基丙烯酰胺、石墨烯掺杂N-叔丁基丙烯酰胺、甲基氯硅烷、苯基氯硅烷、甲基乙烯基氯硅烷、乙基三氯硅烷、丙基三氯硅烷、乙烯基三氯硅烷、γ-氯丙基三氯硅烷和氟硅单体、聚二甲基硅氧烷，多巴胺、烯丙基胺、乙烯、丙烯、丁二烯、苯乙烯、4-乙烯基吡啶、衣康酸、丙烯酸、丙烯酸钠、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、对苯乙烯、乙二醇二甲基丙烯酸甲酯、氯苯乙烯、2-(三氟甲基)丙烯酸、丙烯腈、乙烯醇、乙酸乙烯、丙烯醛、聚氨基甲酸酯和2-羟基丙酸中的一种或二种以上；能通过自组装方式形成高分子材料的聚合物，包括聚砜、聚醚砜和聚芳砜中的一种或二种以上；用于溶解或分散单体或聚合物的溶剂包括水、磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、甲醇、乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，刘路宽，杨开广，李森武，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21