修饰的肠激酶轻链制造技术

本发明专利技术涉及新的哺乳动物肠激酶类似物例如哺乳动物肠激酶轻链类似物和制备其的方法。本文还描述了用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的肠激酶轻链
本专利技术涉及新的哺乳动物肠激酶类似物，制备这种物质的方法和所述哺乳动物肠激酶类似物用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质中的用途。通过引用对序列表的合并序列表，标题为“序列表”，为10 kb，创建于2012年12月17日，通过引用合并入本文。背景 丝氨酸蛋白酶肠激酶(enterokinase)(简称肠激酶或EK),也被称为肠肽酶(enteropeptidase),是异二聚糖蛋白，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ((Asp)4-Lys, DDDDK),其中它选择性地在赖氨酸之后切割。从牛十二指肠粘膜中分离的肠激酶展示150，000的分子量(MW)和35%的糖含量(carbohydrate content)。该酶由重链(MW~115，000)和二硫键连接的轻链(MW~35，000)组成(Li印nieks 等，J.Biol.Chem., 254(5): 1677-1683 (1979))。重链的功能是将酶固定在粘膜的膜上。轻链充当催化亚基。在大肠杆菌(E.coli)中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了该目的需要有加工酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的加工酶。肠激酶是这样的酶，而且已经进行了许多努力以在大肠杆菌中确定重组方法以获得肠激酶或肠激酶类似物。但是，到目前为止结果仍然相当贫乏:可获得的商业产品价格昂贵且特异性活性较低，这是由于沉淀的EK的无效复性或可溶的EK的无效分泌造成的。大肠杆菌中针对可溶性EK产品的方法导致可溶性和不溶性蛋白的混合物，需要2种纯化路线，昂贵的亲和柱，并且总之产量较低。为了获得均一的产品，EK必须被产生为包含体形式的不可溶物质。它们易于分离但是难以以令人满意的产量复性，这是由于蛋白可能聚集。本专利技术的目的是获得具有改进性质的哺乳动物肠激酶类似物。简述 本专利技术涉及在合适位点突变的哺乳动物肠激酶类似物。本专利技术的肠激酶类似物相对于亲本(野生型)哺乳动物肠激酶中氨基酸的一个或多个替换可以例如是疏水氨基酸被亲水的、带电荷的氨基酸替换。在本专利技术的一个方面，获得的牛肠激酶轻链类似物包含在位置134和/或135上的至少一个由疏水氨基酸向亲水带电荷氨基酸的替换。在一个方面，根据本专利技术的牛肠激酶轻链类似物进一步包含在位置112上的替换。本专利技术还涉及在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法。在一个方面，该方法包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸的步骤，以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤，其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。在一个方面，本专利技术提供用于获得哺乳动物肠激酶类似物的改进的生产方法。另外或者可选地，在第二个方面，本专利技术提供改进的生产方法，其导致产量提高。在本专利技术的一个方面，生产牛肠激酶轻链类似物的方法包括以下步骤: a)在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列； b)回收具有包含体形式的肠激酶轻链的细胞 c)溶解并再折叠肠激酶轻链类似物；以及 d)纯化肠激酶轻链类似物。在一个方面，本专利技术提供在细菌或酵母宿主细胞中重组生产肽或蛋白质的方法。在一个方面，所述方法包括: a)在酵母或细菌中表达包含要被生产的肽或蛋白质的融合蛋白； b)用根据方面1-9任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白；以及 c)分离产生的肽或蛋白。本专利技术还可以解决随着示例性的实施方案的公开将会显而易见的其它问题。附图简述 图1 =Trx-EI^ (A)和Trx-EKui⑶表达对诱导时间的依赖。M:标志物；B1:诱导前；12，13，14和16分别代表1PTG的诱导时间(小时)；15%凝胶；使用发酵确定成分培养基(Fermentation defined medium, FDM)。图2:EK纯化的流程图 图3:再折叠过程中的再折叠％产量(图3A)和IL再折叠缓冲液中纯化的E&和EKui的量(mg，图3B)作为Trx-连接肽-EKl和Trx-连接肽-EKui浓度的函数。▲ / Λ: Trx-连接肽-EKl, lmg/ml 包含体(IB) ；./ O: Trx-连接肽-EKlil, 6mg/ml IB: Trx-连接肽-EKlM，4mg/ml IB。1.3g Trx-连接肽-EKui或Trx-连接肽-EKl的细胞沉淀被裂解且包含体被溶解至不同的浓度，即在含有20mM Tris，8M脲，pH8.0，20mM DTT的缓冲液中Trx-连接肽-EKlj 为 lmg/ml, Trx-连接肽-EKlil 为 4mg/ml 或 6mg/ml。在含有 20mM Tris, IM 脲，ImM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释至所指出的浓度并在20°C温育24小时后，如实验部分所述用Q HP层析对EKui/ EKl进行纯化。图4:Trx-EKL的再折叠产量随着温育时间而增加。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲，pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至1.6mg/ml。在含有20mM Tris, IM脲，ImM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20°C分别温育24小时或48小时后，如实验部分所述检测酶活性。图5:再折叠产量对脲浓度的依赖。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有 20mM Tris, 8M 脲，pH8.0, 20mM DTT 的缓冲液中溶解至 1.6mg/ml。在含有 20mM Tris,ImM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3且分别含有OmM, 0.5mM, ImM, 1.5mM或2mM脲的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20°C温育24小时后，如实验部分所述检测酶活性。图6:再折叠产量对氧化还原GSSG/GSH比例的依赖。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲，pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至1.6mg/ml。在含有20mMTris，IM脲，pH 8.3和所指出的GSSG/GSH的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20°C温育24小时后，如实验部分所述检测酶活性。图7:通过Q HP层析纯化ΕΚ?Μ。㈧:层析谱。EKui通过钠梯度洗脱，如P2中所示。含有EK酶活性的级分被标示出。⑶:还原条件下每一步的EKui的SDS-PAGE。EKu1:通过疏水相互作用层析进一步纯化P2获得的高纯度EKui (>90%) ;M:标志物，B1:诱导前，Total:总裂解物；Sup:细胞裂解后的上清；IB:进行再折叠和纯化的包含体；App:再折叠和自活化之后应用于Q HP柱的样品；Pl，P2和P3代表图7A中标出的每个峰的合并级分。(C):酶活性。Λ:P1.1ul样品加入到IOOul反应缓冲液中；.: Ρ2.Ρ2稀释5倍后，Iul稀释的样品加入到IOOul反应缓冲液中；〇:Ρ3.1ul样品加入到IOOul本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种牛肠激酶轻链类似物，其包含在位置134和/或135上的至少一个替换，所述替换是疏水氨基酸被亲水带电荷氨基酸替换。2.根据权利要求1的牛肠激酶轻链类似物，其进一步包含在位置112上的替换。3.根据前述权利要求任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中所述一个或多个亲水带电荷氨基酸是选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的一个或多个氨基酸。4.根据前述权利要求任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中被突变的肠激酶轻链是SEQID NO:1。5.在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法，包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤，其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。6.根据权利要求5的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸选自1、V、L、M、W、F、A07.根据权利要求5-6任一项的方法，其中所述亲水氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组。8.根据权利要求5-7任一项的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于选自位置11-14 (氨基酸AWPW)、位置78-80 (氨基酸I V I)和位置133-136 (氨基酸A L I Y)的一个或多个位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：HF维迪克，张旭家，刘云，佟崴嵬，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：