本发明专利技术公开了一种人绒毛膜促性腺激素hCG β亚基的糖基化变体hCG β1，所述hCG β亚基的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述糖基化变体hCG β1在hCG β亚基的N30位点发生糖基化，在N13位点未发生糖基化。本发明专利技术还公开了包含特定含量的所述糖基化变体hCG β1的人绒毛膜促性腺激素hCG。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人绒毛膜促性腺激素hCGβ亚基的糖基化修饰。具体而言，本专利技术涉及hCGβ亚基的糖基化修饰情况，获得的新的糖基化变体，及其对hCG生物学活性的影响。
技术介绍
人绒毛膜促性腺激素(hCG)由α亚基和β亚基经由非共价二聚组成，其中α亚基与β亚基的分子量分别为10.2kD和15.5kD。hCG是一种高度复杂的蛋白分子，多样化的翻译后修饰，例如甲硫氨酸氧化、N端截断、唾液酸化、糖基化等，是导致hCG分子不均一的主要原因。其中，甲硫氨酸氧化可导致分子空间结构改变，关键位点氧化产生的变体将影响活性；N端截断以及亚基解离，会产生分子大小变体，某些变体将影响活性；唾液酸化程度的不均一将产生电荷变体，这些电荷变体在血液中的半衰期及CG受体的结合可能有不同的行为。而糖基化修饰(包括唾液酸化)是hCG最复杂的翻译后修饰。hCG是一种高度糖基化修饰的蛋白，其糖基化程度超过其分子量的30％，是天然存在的糖基化程度最高的分子。hCG的α亚基有两个N-糖基化位点(52Asn和78Asn)；β亚基有两个N-糖(13Asn和30Asn)修饰位点与4个O糖(121Ser、127Ser、132Ser和138Ser)修饰位点，见图1。并且，不同表达系统将导致寡聚糖分布发生变化；N-糖主要类型为“双天线”和“三天线”寡糖，并在其基础上还会产生唾液酸化、岩藻糖化、甘露糖化等不同变化。由于糖基化的复杂性，hCG糖蛋白分子的分离分析、不同异构体/变体/亚型的分子结构与功能关系的研究一直是该领域的挑战。蛋白药物的糖基化与其体内生物学功能和/或半衰期关系密切。例如促红细胞生成素(EPO)的N-糖中的唾液酸化程度越低，则体内半衰期越短，从而降低其体内生物学功能；抗体N-糖基化的缺失，则会导致其抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖细胞毒作用(CDC)的严重下降。hCG作为一种糖蛋白药物，其糖基化与其在体内的生物活性高度相关，涉及到蛋白的折叠、分泌以及在血浆中的半衰期。已有报道hCGβ亚基的C末端O-糖基化缺失，虽不影响体外受体结合活性，但会大大降低hCG体内活性，且令其体内半衰期缩短。所以，发现新的糖基化亚基并研究其对生物学功能的影响，对hCG的产品质量控制与应用具有重要的意义。因此，本领域仍需要进一步阐明hCG的糖基化水平，发现具有新的糖基化水平的hCG蛋白或其亚基，研究该糖基化水平对hCG活性的影响。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术目的在于提供一种hCGβ亚基变体，该变体具有区别于已经发现的β亚基糖基化状态。本专利技术的另一个目的在于，通过研究所述hCGβ亚基变体的糖基化水平对hCG生物学活性的影响，提供包含特定含量的该hCGβ亚基变体的hCG，该hCG相比于具有其他糖基化情况的hCGβ亚基的hCG，具有更好的生物学活性。本专利技术的还一个目的在于，提供所述hCGβ亚基变体以及包含其的hCG的制备方法。本专利技术的技术方案如下。一方面，本专利技术提供一种人绒毛膜促性腺激素hCGβ亚基的糖基化变体hCGβ1，所述hCGβ亚基的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示，所述糖基化变体hCGβ1在hCGβ亚基的N30位点发生糖基化，在N13位点未发生糖基化。SEQIDNo：1∶SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ优选地，所述糖基化变体hCGβ1经N-糖苷酶F(PNGaseF)处理后，产生氨基酸序列如SEQIDNo：2所示的肽段2-T3和氨基酸序列如SEQIDNo：4所示的肽段2-T4*。其中肽段2-T3的第5个位点为天冬酰胺N，肽段2-T4*的第10个位点为天冬酰胺N的脱酰胺产物，由“isoD”表示的异天冬氨酸。SEQIDNo：2：CRPINATLAVEKSEQIDNo：4：EGCPVCITV(isoD)TTICAGYCPTMTR所述糖基化变体hCGβ1的分子量比hCGβ亚基的糖基化变体hCGβ2的分子量小1913道尔顿，所述糖基化变体hCGβ2在hCGβ亚基的N30位点和N13位点均发生糖基化。优选地，所述糖基化变体hCGβ2经N-糖苷酶F(PNGaseF)处理后，产生氨基酸序列如SEQIDNo：3所示的肽段2-T3*和氨基酸序列如SEQIDNo：4所示的肽段2-T4*。其中肽段2-T3*的第5个位点为天冬酰胺N的脱酰胺产物，由“isoD”表示的异天冬氨酸。SEQIDNo：3：CRPI(isoD)ATLAVEK本文所述的糖基化变体hCGβ1可以通过RP-HPLC法、SDS-PAGE法等方法进行制备。根据本专利技术的一个具体实施方式，通过RP-HPLC法制备本专利技术的糖基化变体hCGβ1，所述RP-HPLC法包括：将hCG浓缩至1～2mg/mL，加入5％的β-巯基乙醇，70℃水浴加热10分钟并冷至室温，进样。所述色谱条件包括：色谱柱：C18键合相，5μm，4.6×250mm；流动相：A.水+0.1％三氟乙酸+0.01％七氟丁酸；B.乙腈+0.1％三氟乙酸+0.01％七氟丁酸；柱温：25℃；流速：0.8ml/min；进样量：100μL/针；洗脱速度：0.00min，18.0％B；0.05min，20.0％B；28.00min，40.0％B；30.00min，100.0％B；31.00min，100.0％B；32.00min，18.0％B；40.00min，18.0％B。根据本专利技术的另一个具体实施方式，通过SDS-PAGE法制备本专利技术的糖基化变体hCGβ1，所述SDS-PAGE法包括：hCG样品浓缩至1～2mg/mL，加入33％的缓冲溶液(每12mL含Trisbase0.303g，0.189mL盐酸，4mL甘油，0.002g溴芬蓝，0.8gSDS，2mLβ-巯基乙醇)，70℃水浴加热10分钟并冷至室温，进行SDS-PAGE凝胶中并电泳。又一方面，本专利技术提供一种分离具有不同糖基化程度的hCG的方法，所述方法包括以下步骤：采用疏水层析法，通过线性洗脱分离并收集hCG中具有不同糖基化程度的级分。优选地，所述疏水层析法的线性洗脱为，以包含1.0M硫酸铵的平衡液为A液，以包含12％乙醇的洗脱液为B液，以100-0％A液与0-100％B液，15-20个柱体积，对hCG进行线性梯度洗脱。优选地，所述方法包括以下步骤：(1)向待分离的hCG中添加硫酸铵至电导率与平衡液3(10mMTris，1.0M硫酸铵，pH7.4)一致，然后进样，进样量2-12mghCG/mL填料；(2)以平衡液3为A液，以洗脱液(10mMTris，12％乙醇，pH7.4)为B液，以100-0％A液与0-100％B液，15-20个柱体积，对hCG进行线性梯度洗脱；(3)分段收集洗脱的级分。更优选地，所述方法还包括在进样前用3-5个柱体积的平衡液3进行平衡的步骤，和/或在进样后用3-5个柱体积的平衡液3进行洗涤的步骤。在本文提供的方法中，步骤(3)的分段收集通过检测洗脱的级分在UV280的吸收值进行；并且，优选地，通过还原CE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人绒毛膜促性腺激素hCG β亚基的糖基化变体hCG β1，所述hCG β亚基的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述糖基化变体hCG β1在hCG β亚基的N30位点发生糖基化，在N13位点未发生糖基化。
【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜促性腺激素hCGβ亚基的糖基化变体hCGβ1，所述hCGβ亚基的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示，所述糖基化变体hCGβ1在hCGβ亚基的N30位点发生糖基化，在N13位点未发生糖基化。2.根据权利要求1所述的糖基化变体hCGβ1，其特征在于，所述糖基化变体hCGβ1经N-糖苷酶F处理后，产生氨基酸序列如SEQIDNo：2所示的肽段2-T3和氨基酸序列如SEQIDNo：4所示的肽段2-T4*。3.根据权利要求1或2所述的糖基化变体hCGβ1，其特征在于，所述糖基化变体hCGβ1的分子量比hCGβ亚基的糖基化变体hCGβ2的分子量小1913道尔顿，所述糖基化变体hCGβ2在hCGβ亚基的N30位点和N13位点均发生糖基化；优选地，所述糖基化变体hCGβ2经N-糖苷酶F处理后，产生氨基酸序列如SEQIDNo：3所示的肽段2-T3*和氨基酸序列如SEQIDNo：4所示的肽段2-T4*。4.一种分离具有不同糖基化程度的hCG的方法，所述方法包括以下步骤：采用疏水层析法，通过线性洗脱分离并收集hCG中具有不同糖基化程度的级分。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述疏水层析法的线性洗脱为，以包含1.0M硫酸铵的平衡液为A液，以包含12％乙醇的洗脱液为B液，以100-0％A液与0-100％B液，15-20个柱体积，对hCG进行线性梯度洗脱；优选地，所述方法包括以下步骤：(1)向待分离的hCG中添加硫酸铵至电导率与平衡液3(10mMTris，1.0M硫酸铵，pH7.4)一致，然后进样，进样量2-12mghCG/mL填料；(2)以平衡液3为A液，以洗脱液(10mMTris，12％乙醇，pH7.4)为B液，以100-0％A液与0-100％B液，15-20个柱体积，对hCG进行线性梯度洗脱；(3)分段收集洗脱的级分。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在进样前用3-5个柱体积的平衡液3进行平衡的步骤，和/或在进...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨嘉明，邓钦培，康健，丁建坤，彭育才，胡振湘，傅道田，朱保国，
申请(专利权)人：珠海市丽珠单抗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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