包括α 2,3-和α 2,6-唾液酸化的重组FSH制造技术

一种包括α 2,3‑ 和α 2,6‑ 唾液酸化的重组 FSH。包含重组FSH(rFSH)的制剂。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2009年4月16日、专利技术名称为“包括α2,3-和α2,6-唾液酸化的重组FSH”的中国专利申请No.200980121391.X的分案申请。本专利技术涉及用于治疗不育的促性腺激素。具体地，本专利技术涉及促卵泡激素(FSH)。所述促性腺激素是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。它们包括促卵泡激素(FSH),黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。FSH由垂体前叶腺自然分泌，并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。FSH包含对于其它糖蛋白激素LH和CG也是常见的92个氨基酸的α-亚基，以及赋予该激素生物学特异性的FSH独有的111个氨基酸的β-亚基(Pierce和Parsons,1981)。每个亚基通过增加复杂的糖残基进行翻译后修饰。两个亚基都携带关于N-连接的聚糖附着的2个位点，α亚基在氨基酸52和78处，β-亚基在氨基酸残基7和24处(Rathnam和Saxena,1975,Saxena和Rathnam,1976)。因此，FSH糖基化到约30质量％(Dias和Van Roey.2001.Fox等2001)。从更年期后人尿中纯化的FSH已经在不育治疗中使用了许多年；其在自然生殖中促进排卵并且提供卵母细胞用于辅助生殖技术。FSH的两种重组形式，Gonal-F(Serono)和Puregon(Organon)在20世纪90年代中期是可获得的。这些都在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达(Howles,1996)。存在与FSH制剂相关的相当大的异质性，其涉及在存在的不同的同分异构体的量上的不同。单独的FSH同工型显示相同的氨基酸序列，但是在它们翻译后修饰的程度上不同；具体的同工型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同，这两者都显示影响具体的同工型生物活性。自然FSH的糖基化是高度复杂的。在自然来源的垂体FSH中的聚糖可以包含广泛范围的结构，其可以包括二触角聚糖、三触角聚糖和四触角 聚糖的组合(Pierce和Parsons,1981.Ryan等.,1987。Baenziger和Green,1988)。所述聚糖可以具有其它的修饰:核心岩藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙酰基乳糖胺延伸的链、部分或完全唾液酸化(sialylation),具有α2,3和α2,6连接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺(Dalpathado等，2006)。此外，在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。在来自个体的血清以及来自绝经期后妇女尿液的FSH中已经发现相当水平的聚糖复杂性(Wide等.,2007)。重组FSH产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。现存的rFSH产品来自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在CHO来源的rFSH中的聚糖修饰范围比在来自垂体提取物或尿液的天然产物中发现的那些更有限。在CHO来源的rFSH中发现的减少的聚糖异质性的实例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺延伸(Hard等,1990)。此外，CHO细胞仅能够使用α2,3连接加入唾液酸(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。这不同于天然产生的FSH，其包含具有α2,3和α2,6-连接的唾液酸混合物的聚糖。已经证实当与垂体、血清或绝经期后尿液FSH比较时，重组FSH制剂(Organon)在具有低于4的等电点(pI)的FSH(考虑酸性同工型)的量上不同(Ulloa-Aguirre等.1995)。与重组产物Gonal-f(Serono)和Puregon(Organon)比较，在尿制备物中的酸性同工型的量高得多(Andersen等.2004)。这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸，因为用硫酸盐修饰的带负电荷的聚糖的含量在FSH中很低。与天然FSH比较，更低的唾液酸含量是两种商购FSH产品的特征，并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和Driebergen,2005)。存在大量的科学工作，其分析并尝试解释在不同个体之间的FSH糖基化变化以及在排卵周期过程中的变化。一项重要讨论涉及这样的观察，即FSH浓度和唾液酸含量在所述周期的排卵前期过程中都减少。减少的唾液酸含量导致更具碱性的FSH，其都清除地更快，并且在体外至少在靶受体处更有效(Zambrano等1996)。关于这些变化的生物相关性以及它们可以怎样涉及选择优势卵泡的问题仍旧未得到解决(由Ulloa-Aguirre综述,2003)。已经关于来自多种来源的物质记载了FSH的循环寿命。这些物质中的一些已经基于总分子电荷进行分离，如通过它们的pI表征，其中更多的酸等同于更高的负电荷。如以前所指出的，对于总分子电荷的主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。例如，rFSH(Organon)具有约8mol/mol的唾液酸含量，而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量(de Leeuw等.1996)。在大鼠中的相应血浆清除率是0.34和0.14ml/min(Ulloa-Aguirre等.2003)。在另一个实例中，其中将重组FSH样品分为高和低pI级分，高pI(更低唾液酸含量)级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D’Antonio等.1999)。已经报道在排卵周期的后期阶段循环的更具碱性的FSH是由于α2,3唾液酸-转移酶在垂体前叶中的下调，其由增加水平的雌二醇所导致(Damian-Matsumara等.1999.Ulloa-Aguirre等.2001)。尚未报道关于α2,6唾液酸-转移酶的结果。FSH和rFSH的总唾液酸含量不是直接可比较的，因为唾液酸一般通过两种方式连接。垂体/血清/尿FSH都包括α2,3和α2,6-连接的唾液酸，其中主要为前者。然而，CHO细胞来源的重组体仅包括α2,3(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。除了后者更低的唾液酸总含量以外，在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异。CHO细胞普遍用于生产药用人重组蛋白。结构分析已经鉴定唾液酸专门通过α2,3-连接来连接。(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。许多人糖蛋白包括α2,3-和α2,6-连接的混合物。因此，使用CHO系统表达的重组蛋白在它们的末端唾液酸连接类型上与它们的天然对应物不同。在生产药用的生物制剂上这是一项重要的考虑因素，因为糖部分可以有助于所述分子的药理学性质。具有这样的rFSH产品是理想的，所述rFSH产品更接近地复制或模拟由人尿生产的产品的生理化学和药物代谢动力学性质。具有这样的rFSH产品是理想的，其与已知重组产物比较，具有一种或多种提高的药物代谢动力学性质。根据本专利技术，提供这样的重组FSH(“rFSH”或“recFSH”)，其包括α2,3唾液酸化和α2,6唾液酸化和,任选地,α2,8唾液酸化。根据本专利技术的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的10％以上是α2,3-唾液酸化，例如全部唾 液酸化的65-85％可以是α2,3-唾液酸化。本专利技术的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的50％以下可以是α2,6-唾液酸化，例如全部唾液酸化的15-本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组FSH(rFSH)，其包括α2,3‑和α2,6‑唾液酸化，其中全部唾液酸化的20至70％是α2,3‑唾液酸化。

【技术特征摘要】
2008.04.25 EP 08251528.9;2008.04.16 US 61/045,4241.重组FSH(rFSH)，其包括α2,3-和α2,6-唾液酸化，其中全部唾液酸化的20至70％是α2,3-唾液酸化。2.根据权利要求1的重组FSH，其中所述重组FSH具有6mol/mol至15mol/mol的唾液酸含量[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]。3.根据权利要求1或2的重组FSH，其中全部唾液酸化的20至60％是α2,3-唾液酸化。4.根据权利要求1、2或3的重组FSH，其中全部唾液酸化的20至50％是α2,3-唾液酸化。5.根据任一在前权利要求的重组FSH，其中全部唾液酸化的40至50％是α2,3-唾液酸化。6.根据任一在前权利要求的重组FSH，其不包括α2,8-唾液酸化。7.根据任一在前权利要求的重组FSH，其具有8mol/mol至15mol/mol的唾液酸含量[以唾液...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊恩·科廷厄姆，丹尼尔·普拉克辛，理查德·博伊德·怀特，
申请(专利权)人：辉凌国际制药瑞士有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH