本发明专利技术涉及一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。所述亲和层析的填料为capto blue（high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。本发明专利技术优化了纯化工艺，使纯化过程简单化，收率明显提高，效价高于现有工艺，另外设备占地面积缩小，车间耗能变小。本发明专利技术中，预处理后绒促性素的效价为200iu/mg左右，而经三次层析处理后绒促性素的效价可达10000iu/mg左右，效价显著提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药
，涉及一种绒促性素纯化方法。
技术介绍
绒促性素（Chorionic Gonadotrophin）系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。对女性可促进卵泡的成熟及排卵，并维持黄体的功能。对男性，能刺激睾丸间质细胞的发育，增加雄激素分泌，促使睾丸下降和男性第二性征发育。与尿促性素合用，可模拟生理性的促黄体生成素高峰，而触发排卵。临床上绒促性素至今仍是治疗月经失调、无排卵性不孕症、先兆流产和习惯性流产、隐睾症、男性性功能低下等的首选药物。1928年，Zondek和Ascbheim首先用乙醇沉淀法，从孕妇尿中取得了活性物质，其他研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究。而现有的方法是粗品加溶剂提取后板框过滤，在用酒精沉淀，离心获得中间体，再进行一步上柱，沉淀，离心，干燥获得产品。但该过程复杂，收率低，效价最高只有5000iu/mg左右。如CN104497128A，提供了一种低盐抽提法从粗品中提取绒促性素的方法，但该方法效价也不理想。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种绒促性素纯化方法。该方法优化了纯化工艺，使纯化过程简单，收率明显提高，效价高于现有工艺。本专利技术提供了如下的技术方案：一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。本申请的纯化方法，分三步层析，可使得到的绒促性素固体纯度高、效价高。在上述方案中优选的是，所述亲和层析的填料为capto blue （high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。在上述任一方案中优选的是，包括以下各步骤：（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液，所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，取沉淀得固体；（2）第一步层析：步骤（1）得到的固体进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A；（3）第二步层析：步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）疏水层析得蛋白溶液B；（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C；（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，沉淀后收集固体，即得绒促性素固体。在上述任一方案中优选的是，步骤（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%，搅拌、沉淀后取上清液，所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体。乙醇浓度为45-55%时可使杂质全部沉淀，蛋白质不沉淀，然后取上清液，再加入乙醇使其浓度为80-90%时，可使蛋白基本沉淀。乙醇浓度高时能把蛋白质沉淀，离心后得到固体，经乙醇处理，利于固体析出。如果直接用绒促性素粗品上柱，由于缓冲体系不一样，不容易吸附在柱子上。在上述任一方案中优选的是，步骤（2）第一步层析：将步骤（1）得到的固体溶于平衡液1，进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A，以平衡液1平衡、洗杂液1洗杂、洗脱液1洗脱；其中，平衡液1：50 nmol tris缓冲液中加100nmol NaCl；洗杂液1： 50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl，再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%；洗脱液1：50 nmol tris缓冲液中加2 mol NaCl，再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。在上述任一方案中优选的是，步骤（3）第二步层析：将步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high sub）疏水层析得蛋白溶液B，以平衡液2平衡；其中，平衡液2: 10nmol Hepes缓冲液中加1.5 mol NaCl。在上述任一方案中优选的是，步骤（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C，以平衡液3平衡，洗脱液3洗脱；其中，平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液；洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加 150 nmol NaCl。在上述任一方案中优选的是，步骤（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%，沉淀过夜，再用3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。80-90%的乙醇利于蛋白质沉淀。在上述任一方案中优选的是，步骤（1）所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。在上述任一方案中优选的是，步骤（2）还包括为蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液1中，其中缓冲液1：10nmol Hepes缓冲液中加1.5mol NaCl。其中，浓缩是为了进一步置换缓冲液，置换了缓冲液更利于下一步的蛋白在柱子上的吸附。在上述任一方案中优选的是，所述置换时，所用所述缓冲液1的体积为蛋白溶液A浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液1的pH值用氢氧化钠或盐酸为7.5±0.2。在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。在上述任一方案中优选的是，步骤（3）还包括含蛋白溶液B的超滤步骤，将所述蛋白溶液B进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液2中，其中缓冲液2：10 nmol Tris缓冲液。在上述任一方案中优选的是，所述置换时，所用所述缓冲液2的体积为蛋白溶液B浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。在上述任一方案中优选的是，步骤（3）中使用的填料Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）采用再生液2再生，所述再生液2: 10nmol Hepes缓冲液。在上述任一方案中优选的是，所述再生液的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为pH7.5±0.2。在上述任一方案中优选的是，步骤（4）还包括含蛋白溶液C的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液C浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液3中，其中缓冲液3: 0.15 mol乙酸铵溶液。所述置换时，所用所述缓冲液3的体积为蛋白溶液C浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液3的pH值用氨水或乙酸调节为 5.5±0.2。在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。在上述任一方案中优选的是，步骤（4）中使用的填料DEAE Sepharose Fast Flow 采用再生液3再生，所述再生液3: 10 nmol Tris缓冲液中加1 mol Na本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。
【技术特征摘要】
1.一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。2.根据权利要求1所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：所述亲和层析的填料为capto blue （high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。3.根据权利要求2所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：包括以下各步骤：（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，再加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液，所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，取沉淀得固体；（2）第一步层析：步骤（1）得到的固体进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A；（3）第二步层析：步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high sub）疏水层析得蛋白溶液B；（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C；（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，沉淀后收集固体，即得绒促性素固体。4.根据权利要求3所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%，搅拌、沉淀后取上清液，所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体。5.根据权利要求4所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（2）第一步层析：将步骤（1）得到的固体溶于平衡液1，进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A，...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏星辉，胡晶锦，王群芳，
申请(专利权)人：宁波人健药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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